Metodos Para Identificar Proteinas

Métodos p/identificar proteínas

La Proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función. Las proteínas son partes vitales de los organismos vivos, ya que son los componentes principales de las rutas metabólicas de las células. El término proteómica fue acuñado en 1997 por Marc Wilkins.

A continuación se presentan los métodos utilizados más ampliamente en los diversos laboratorios para la identificación de proteínas

La REACCION DE BIURET, identifica la presencia de proteínas, por sus enlaces pepiticos.

En un tubo de ensayo se coloca 1 ml. de solución Albumina y 2 ml. de solución de NAOH al 10%; se le agregan 2 o 3 gotas de solución de sulfato de cobre al 5%; se observa una coloración violeta en la solución, resultado positivo a la presencia de proteínas. Esto se lee a 540nm; como estándar se utiliza una solución de albumina.

La Espectrometría de Masas es una tecnología analítica esencial en el contexto de la proteómica actual debido a su alta capacidad de análisis, su sensibilidad y su precisión en la determinación de masas moleculares proteicas.

Es una técnica cuantitativa como cualitativa de alta sensibilidad y universal.

La degradación de Edman, desarrollado por Pehr Edman, es un método de secuenciación de aminoácidos en un péptido. El isotiocianato de fenilo se hace reaccionar con un grupo amino terminal sin carga, en condiciones ligeramente alcalinas, para formar un derivado de feniltiocarbamoil cíclico. Entonces, en condiciones ácidas, este derivado del aminoácido terminal se escinde como un derivado de tiazolinona. El aminoácido tiazolinona se después se extrajo selectivamente en un disolvente orgánico y se trata con ácido para formar el feniltiohidantoina más estable - derivado de aminoácido que se puede identificar mediante el uso de cromatografía o electroforesis.

La huella peptídica o PMF (del inglés Peptide mass fingerprinting), es una técnica analítica de identificación de proteínas desarrollada en 1993 por varios equipos de investigación de forma independiente.1 2 3 4 5 En este método, la proteína desconocida en estudio se hidroliza por acción de proteasas específicas de secuencia (generalmente la tripsina) en pequeños péptidos cuyas masas absolutas pueden determinarse mediante un espectrómetro de masas acoplado al detector adecuado, como el MALDI-TOF o el ESI-TOF.6 Las masas obtenidas son comparadas con una base de datos biológica de proteínas cuya secuencia se conoce o bien de información genómica, esto es, mediante un enfoque in silico. Para este menester se emplean herramientas de software capaces de traducir las secuencias nucleotídicas del genoma, depositadas en la base de datos, a secuencias de aminoácidos (esto es, los componentes de las proteínas); luego, se corta teóricamente la secuencia de la cadena polipeptídica y se calculan las masas absolutas de los péptidos obtenidos. La ulterior comparación entre huella de tamaños de péptidos obtenida con las depositadas en la base de datos permite asociar estadísticamente la proteína desconocida con la más semejante de la base de datos (asociació que puede ser de identidad). La mayoría de las bases de datos asumen que la proteína está constituida de un sólo péptido, lo que supone una desventaja.7

Para el uso de la técnica de la huella peptídica debe disponerse de la proteína pura, o, de existir mezclas de dos o tres, debe acoplarse un MS/MS adicional. Como paso preparativo, el aislamiento de la proteína de interés suele realizarse mediante electroforesis en gel bidimensional o mediante electroforesis SDS-PAGE. Los análisis adicionales mediante MS/MS pueden ser directos, generalmente mediante MALDI-TOF/TOF o nanoLC-ESI-MS/MS análisis de los elementos recortados del gel de electroforesis bidimensional

Análisis MS/MS: la muestra se somete a Espectrometría de masas de ionización por electrospraydespues se realiza La comparación de los datos del espectro de fragmentación experimental con los almacenados en bases de datos es similar al llevado a cabo en la identificación por huella peptídica: las coincidencias entre los datos experimentales y los datos del servidor se muestran en orden decreciente de probabilidad. Para evaluar la identificación de la proteína se ha de tener en cuenta su presencia en las bases de datos, maximizar la asignación de fragmentos generados y comprobar si las características de la proteína identificada y la proteína problema coinciden. No obstante, para mejorar la precisión de la identificación es recomendable repetir varias veces el proceso de identificación del péptido, para disponer así de varios espectros de fragmentación.

Las interacciones proteína-proteína (IPP) operan en casi todos los niveles de las funciones celulares; y la mayoría de las proteínas forman parten de algún tipo de complejo proteico en algún momento particular de la vida de una célula. La mayoría de la proteína funciona en colaboración con otras proteínas, y una meta de la proteómica es identificar cuales proteínas interactúan. Esto es especialmente útil para determinar socios potenciales en las cascadas de señalización celular.

Se dispone de varios métodos para probar las interacciones proteína-proteína. El método tradicional es el sistema de doble híbrido de la levadura. Los métodos nuevos incluyen microarrays de proteína, cromatografía de inmunoafinidad seguida por espectrometría de masas, interferometría de doble polarización y métodos experimentales como phage display y métodos computacionales.

Fuentes de consulta:

o http://centrodeartigos.com/articulos-enciclopedicos/article_88905.html

o http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/4.1InstrumentacionEspectrometriadeMasas_2462.pdf

o http://es.wikipedia.org/wiki/Huella_pept%C3%ADdica

o http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%B3mica

o http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%B3mica#Identificaci.C3.B3n_de_prote.C3.ADnas

o http://macromoleculas.unq.edu.ar/alumnos/Interacciones.pdf

o http://www.buenastareas.com/ensayos/Identificacion-De-Proteinas/4863015.html

o http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio//es_ES//investigacion/cromatografia/espectrometria_de_masas.pdf

o http://www.uco.es/servicios/scai/pdf/identificacion_de_proteinas.pdf

o http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA3PROTEINASalumno.pdf

Electroforesis

Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un

campo eléctrico).

Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas,

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