Microbilogia

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE[pic 1]

CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS, REACTIVOS Y HOMOGENEIZADOS

Pablo E. Milian Mindiola

Microbiólogo Agroindustrial

1. OBJETIVO

Establecer los lineamientos para la preparación, esterilización, conservación y control de calidad de medios de cultivos, homogeneizados y reactivos en el laboratorio de microbiología.

1. GENERALIDADES Y DEFINICIONES

ASPECTOS A TENER EN CUENTA PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS.

• Utilizar preferiblemente, los medios de cultivo deshidratados que ofrecen las firmas comerciales, pero se pueden preparar en el laboratorio a partir de los componentes especificados en la formulación.
• Los componentes que están en pequeñas concentraciones o son poco solubles, es mejor añadirlos en forma de soluciones acuosas filtradas, soluciones  alcohólicas o alcalinas.
• Los componentes como: hidratos de carbono, yema de huevo y sulfito sódico deben prepararse a parte de los demás componentes del medio, y ser añadidos al medio de cultivo base en condiciones asépticas.
• Disolver los medios por calentamiento hasta ebullición en constante agitación.
• Dejar enfriar los caldos a temperatura ambiente y los medios de cultivos a 50ºC, antes de utilizarlos.
• Ajustar el pH del medio agregando solución NaOH o HCl 0.1N según el caso. Si el pH obtenido es ácido, agregar solución NaOH hasta ajustar. Si el pH es alcalino agregar solución HCl hasta ajustar.
• Dejar secar las placas con medios de cultivo, al lado del mechero con las cajas de petri destapadas.
• Cerrar muy bien los tubos y recipientes con soluciones o caldos de cultivo, para evitar derramamiento por el efecto de la ebullición.
• Conservar los medios y reactivos en sus envases originales, a temperatura no mayor a 30 °C fuera de la exposición a la luz y la humedad.
• Conservar los medios y caldos de cultivos preparados, en la nevera entre 2 y 6 °C de temperatura.
• No utilizar los medios de cultivo deshidratados que presenten alteraciones de color, que se observen apelmazados o que superen la vigencia establecida por la casa comercial.
• Seguir las indicaciones del fabricante para la rehidratación y esterilización de los medios de cultivo.

CONTROL NEGATIVO: Una cepa cuyo crecimiento y comportamiento no puede evidenciarse, debido a sus características fisiológicas y bioquímicas, en el medio de cultivo utilizado para el analito en cuestión.

CONTROL POSITIVO: Una cepa cuyo crecimiento es favorable, en el medio de cultivo utilizado para el analito en cuestión.

CULTIVO: Es un método utilizado para la multiplicación de microorganismos, tales como bacterias y hongos, en el que se prepara unas condiciones óptimas para favorecer el proceso deseado. Pueden ser de dos tipos:

• Caldos de cultivo: Son cultivos de crecimiento líquidos y generalmente se preparan en tubos de ensayos.

• Medios de cultivos: Son cultivos de crecimiento sólidos y generalmente se preparan en cajas de petri grande y pequeñas, se solidifican a una temperatura menor de 45 °C.

DILUYENTE: Es una solución preparada a partir de unos componentes básicos, cuya función radica en disminuir las concentraciones microbianas de una población, para poder ser examinadas en el laboratorio. Ejemplo: Solución peptona 0,1 %, solución salina 0,85 %.

FUNDIR: Acción en la que se transforman los medios de cultivos sólidos y semisólidos, a el estado líquido para permitir su manipulación en las actividades de realización de ensayos.

SOLUCIÓN: Es una mezcla homogénea a nivel molecular o iónico de dos o más sustancias, que no reaccionan entre sí.

1. NORMAS DE SEGURIDAD

• Lavarse las manos antes y después de realizar las labores de limpieza.
• Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de protección.
• No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el área de trabajo.
• No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los elementos y productos de limpieza y desinfección.

1. MATERIALES Y EQUIPOS

Frascos de vidrio con tapa rosca

Agar SPC (Standard Plate Count)

Agar EMB (Eosin Metilen Blue)

Agar Bismuto Sulfito

Peptona Buferada

Caldo Brilla

Vidrios de reloj

Autoclaves

Baño Serológico

Mechero

Trípode

Plancha calentadora

Cajas Petri

Tubos de ensayo

Campanas de Durham

1. METODOLOGÍA

1. Preparación de medios de cultivos.

Indicaciones generales: La preparación de los medios de cultivos consiste básicamente en seguir las indicaciones del fabricante, las cuales se encuentran en el inserto de cada medio de cultivo o reactivo. A continuación se describes las instrucciones generales para preparar los medios de cultivos y reactivos utilizados en el laboratorio de microbiología:

• Leer cuidadosamente las indicaciones descritas en el inserto del frasco.
• Pesar en la balanza la cantidad necesaria del polvo.
• Cerrar inmediatamente los frascos con medios de cultivos, para evitar que la humedad altere sus características.
• Disolver el polvo deshidratado en agua destilada o desionizada.
• Agitar la mezcla, hasta disolver completamente el polvo (En los casos de caldos de cultivo). En los casos donde los medios de cultivos contienen agar, disolver en baño de vapor y en constante agitación hasta no observar grumos.
• Medir el pH de la mezcla utilizando un pH-metro; si no está disponible, utilizar tirillas indicadoras de pH.
• Si es necesario (Observar en el inserto el requerimiento de pH), ajustar el pH con una solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) 0,1N ó solución de Ácido Clorhídrico (HCl) 0,1N.
• Generalmente para los medios líquidos, servir 10 mL en tubos de ensayos taparrosca, posteriormente incluir en ellos, campanas de Durham y cerrar.
• Esterilizar en autoclave 121 °C, 15 PSI durante 15 minutos ó según indicaciones del fabricante.
• Distribuir 20 a 25 ml de medio de cultivo por caja de Petri.
• Esperar que solidifiquen.
• Rotular el material, describiendo el nombre del medio de cultivo (Para placas de cultivo) y la fecha de preparación.

1. Esterilización.

• Seguir las instrucciones del proveedor; generalmente, la esterilización de un medio de cultivo se realiza a 121°C, 15 PSI durante 15 minutos, pero existen medios que requieren condiciones especiales de esterilización.
• Verificar el cumplimiento de los tiempos para alcanzar la temperatura de esterilización, con el fin de evitar la degradación de ciertos componentes del medio.
• Cuando se esterilizan volúmenes grandes de medio de cultivo, la duración del calentamiento es más elevada, y podría ocasionar degradación de algunos componentes.
• Después de culminado el proceso de esterilización, reducir la presión del equipo paulatinamente para evitar que la ebullición espontánea del medio levante las tapas del recipiente y se genere derramamiento.

1. Conservación de los medios de cultivo preparados.

• Conservar los medios en la nevera entre 2 y 6°C,
• Almacenar los medios de cultivos durante máximo tres meses.
• No utilizar los medios de cultivo que presenten signos de deshidratación.
• Los caldos de cultivo almacenados en tubos de ensayos deben ser conservados por una semana como máximo.

1. Licuefacción de los medios de cultivos.

• Fundir los medios de cultivos en un baño-maría hirviente. Evitar calentar durante un periodo de tiempo prolongado.
• Antes de servir; conservar los medios de cultivo disueltos en baño-maría a 45 - 50°C.
• Servir los medios de cultivos cuando estos se encuentren a una temperatura entre 45 – 50 °C.
• No mantener licuado un medio durante más de 4 horas y no fundir un medio de cultivo más de una vez.
• Verter de 20 a 25 ml de medio en las cajas de Petri grandes y verter de 5 a 10 ml de medio en cajas Petri pequeñas.
• Cuando se realiza siembra en profundidad; agregar de 20 a 25 ml de medio de cultivo por caja de Petri.

1. Preparación de homogenizados

• Utilizar puntas o pipetas estériles, para tomar las alícuotas de muestras y realizar las diluciones.
• Utilizar para cada dilución una punta o pipeta estéril.
• No preparar diluciones o placas fluidas bajo la luz solar directa.
• Proteger los extremos de las pipetas, del contacto con la superficie de los mesones, guantes, recipientes de muestras y de otros materiales, para evitar contaminación cruzada.
• Introducir las puntas o las pipetas a una profundidad no mayor de 2.5 cm, en las muestras o en los tubos con diluyente.
• Depositar las porciones de muestra ubicando la pipeta en un ángulo aproximado de 45º, con el extremo tocando el fondo de la caja de Petri.
• Levantar la tapa de la caja Petri cuidadosamente para evitar el contacto de los bordes con la pipeta.
• Drenar la alícuota contenida en la pipeta durante unos segundos, afincando la punta de la pipeta sobre un punto seco de la caja de Petri.

1. Preparación de diluyentes.

1. Agua Peptonada al 0.1%.

• Pesar en la balanza un (1) gramo de peptona.
• Agregar en un recipiente de vidrio la cantidad pesada y completar con agua destilada un volumen de 1000 mL.
• Agregar 9, 99 ó 225 mL de solución peptona 0,1% en tubos de ensayos taparrosca o frascos según el caso, y cerrar correctamente.
• Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 PSI durante 15 minutos.

1. Solución salina isotónica.

• Pesar en la balanza 8,5 gramos de Cloruro de Sodio (NaCl).
• Agregar en un recipiente de vidrio la cantidad pesada y completar con agua destilada un volumen de 1000 mL.
• Agregar 9, 99 ó 225 mL de solución salina en tubos de ensayos taparrosca o frascos según el caso, y cerrar correctamente.
• Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 PSI durante 15 minutos.

1. Preparación de diluciones.

• Agitar cuidadosamente las muestras 25 veces, para homogeneizar.
• Preparar diluciones consecutivas de la muestra, (10-1, 10-2, 10-3,10-n etc.) según el criterio establecido para cada una de ellas.
• Preparar la dilución 10-1 de muestras, midiendo10 ml de la muestra en un frasco de dilución que contenga 90 ml del agua peptonada 0.1% o sea el caso su proporción equivalente 1/9 (1 ml de muestra en 9 ml de diluyente).
• Transferir  10 ml de la muestra, en un frasco de dilución con 90 ml de agua de peptona 0.1%, para obtener una dilución 10-1.
• Agitar vigorosamente el frasco, dejar en reposo.
• Preparar la dilución 10-2, transfiriendo 1ml de la dilución 10-1, a un tubo de dilución que contenga 9ml de agua peptonada 0.1%, agitar cuidadosamente.
• Preparar la dilución 10-3, transfiriendo 1ml de la dilución 10-2, a un tubo de dilución que contenga 9 ml de agua peptonada 0.1%, agitar cuidadosamente.
• Repetir estos pasos hasta obtener el número de diluciones necesarias. Cada dilución sucesiva disminuirá 10 veces la concentración.

El rango de diluciones preparadas puede modificarse en función a la cifra de microorganismos esperada. Se deben analizar siempre tres diluciones consecutivas.

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