Mites

         Resumen.

Abstract

La identificación de los ácaros que causan alergia se basa en las características morfológicas, la taxonomía molecular de ADN  ribosómico (ADNr) el cual puede ser útil en el análisis de cultivos de ácaros y fracciones de ácaros purificados en la producción de extractos alergénicos. De larga duración espaciadores transcritos internos (ITS1 e ITS2) se obtuvieron de diversos generos algunos primers específicos de ácaros.

Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los productos fueron digeridos con la restricción de HpaII y RsaI enzimas con el fin de producir especies de PCR específico restringido polimorfismo de longitud de fragmentos (RFLP) perfiles. Un paso re-amplificación semi-anidada se introdujo antes de la RFLP con el fin de aplicar el método a muestras ambientales. Los resultados demuestran que secuencias de ADNr se pueden utilizar para la identificación inequívoca de especies de ácaros.

Sistema de PCR-RFLP permite la identificación de las especies de ácaros en las fracciones purificadas cuando la disponibilidad de los cuerpos de ácaros adultos intactos para la identificación morfológica es limitado,  siendo fiable y directo y las secuencias de ADNr obtenidos puede ser de utilidad en la identificación de especies de ácaros que causan alergia

Objetivos

Identificar especies de acaros que causan alergia, en base  a secuencias de ADNr ya que de esta manera se podrá economizar en tiempo y dinero para la identificación de dichos alérgenos.

Utilizar diversas tecnicas  como enzimas de resctriccion, PCR–RFLP

Justificacion

         Las alergias pueden causar desde una simple inflamación local hasta la muerte, debido a esto determinar los agentes causantes de dicha enfermedad es una tarea de suma importancia. Mediante el uso de marcadores moleculares como rDNA  (DNA ribosomal) y la técnica de PCR-RFLP ( fragmentos de restricción de polimorfismos) logran la identificación de  grandes tipos de ácaros.

Materiales y métodos

Ácaros

Se estudiaron diez especies de ácaros que pertenecían a siete géneros diferentes, Blomia tropicalis, Acarus siro Linnaeus, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssus, Euroglyphus maynei, Glycyphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus fanetzhangorum, Tyrophagus putrescentiae, Tyrophagus longior, Thyrophagus neiswanderi y Acarus farris. La muestra de ácaro a ser identificada fue puesta en un portaobjetos y analizada en el microscopio.

Muestras ambientales

Las muestras de polvo fueron recolectadas con una aspiradora, tamizadas y almacenadas a -60°C hasta que fueron requeridas para la extracción del alérgeno. El contenido alergénico de Derp 1 y Derf 1  fue determinado mediante ELISA.

 Extracción de ADN

El ADN genómico fue purificado a) de los ácaros recolectados individualmente, b) colonias de ácaros en crecimiento en medios de cultivo, c) fracciones purificadas obtenidas del tamizaje de colonias completas, d) muestras domésticas. El ADN de los ácaros individuales y de los que se encontraban fue extraído y purificado   mediante el método de fenol-cloroformo.  La extracción de las muestras domésticas y las fracciones purificadas se realizó con el kit DNeasy Blood and Tissue.

Amplificación del ADNr

La amplificación con PCR se realizó utilizando los cebadores específicos de los ácaros FNav, basado en el extremo 3´ del ADNr de la secuencia de 18S.  y en RNav 2 , basado en el extremo 5’ terminal del ADNr de la secuencia de 28S. El producto de la PCR contenía el extremo 3’ de la subunidad 18, las secuencias completas de ITS1, la subunidad  5.8S y ITS2,y el extremo 5´de la subunidad 28S.

Todos los productos de la PCR fueron visualizados después mediante la electroforesis en gel de agarosa usando buffer TAE y  bromuro de etidio.

Clonación y secuenciación de los productos de la PCR

Los productos purificados de la PCR fueron ligados al vector pGEM-T y clonados en E. Coli. Diez colonias fueron seleccionadas al azar para purificación de plásmidos e inserto de la secuencia. Las secuencias fueron inicialmente obtenidas utilizando los cebadores SP6 y T7. Después se diseñaron dos cebadores internos de acuerdo a una región conservada en la subunidad 5.8S: Fast5.8 y Rast5.8, que fueron utilizados tanto en la secuenciación clon como en la secuenciación directa de los productos de la PCR. La secuenciación directa de los productos de la PCR de D. farinae, D. pteronyssinus y B. tropicalis, fue realizada utilizando los primers FNav, RNAv2, Fast5.8 o Rast5.8 en un analizador de DNA 3730.

Análisis de la secuencia

Para todos los casos, las secuencias sentido y antisentido de las hebras, fue editado utilizando el software 4Peaks para obtener lecturas de longitud completa.

Análisis con PCR-RFPL

La amplificación con PCR se llevó acabo utilizando los cebadores FNav y RNav. Los productos no purificados de la PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción  HpaII o RsaI. La reacción con las enzimas de restricción se realizó a 37°C   con un termociclador  para minimizar la evaporación y evitar la digestión parcial; durante dos horas en un volumen final de 20 µL conteniendo 8-11 µL de producto de la PCR, 2 µL de buffer Sure/Cut y cuatro unidades de la enzima correspondiente. Los fragmentos resultantes de la digestión fueron separados en geles de agarosa al 2%.

Análisis con PCR-RFLP en las muestras ambientales

Ningún producto de PCR fue visualizado después de la amplificación del DNA purificado a partir de muestras ambientales mediante el protocolo estadarizado. Así , el sistema PCR-RFLP fue adaptado para estas pruebas utilizando el Kit DNeasy Blood and TIssue para la extracción de ADN, e introduciendo el paso de la  re- amplificación antes del RFPL. La re-amplificación consistió en una reacción semianinada usando los cebadores FNav y RAst5.8, amplificando la región de longitud completa ITS1 rodeada de secuencias parciales de subunidades 18S y 5.8S . El ciclo de amplificación y el procedimiento de RFLP no difieren de los descritos anteriormente. Los fragmentos digeridos resultantes fueron separados en gel de agarosa 3%.

Discusion

Las secuencias obtenidas se han utilizado para identificar especies utilizando claves taxonómicas. Sin embargo, la identificación por secuenciación requiere la clonación, ya que es intraespecífica o polimorfica intra-individual y pueden complicar las lecturas de secuenciación directa, como se observó en tres de las especies analizadas.

[pic 1]

[pic 2]

[pic 3]

Vale la pena señalar que el polimorfismo intraespecífico o intra-individual detectado no afecta la especificidad de especies de las secuencias. Cada especie de clon polimórfico obtiene unas formas inequívocas agrupadas juntas en el árbol filogenético construido después del alineamiento.

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