MÉTODO INDIRECTO INMUNOFLUERECENCIA

MÉTODO INDIRECTO INMUNOFLUERECENCIA

Se basan en que, cualquier antígeno, puede ser marcado específicamente con un fluorocromo coloreado, a través de un anticuerpo (ac) específico. cuando se irradia este elemento con luz ultravioleta o azul se hace fluorescente.

el antisuero (por ejemplo el de antisalmonela preparado en conejo) no se marca, sino que se emplea conjugado con suero antiglobulina fluorescente, a través de una técnica en dos tiempos. la extensión con la bacteria en cuestión se “inunda” con el suero conejo antibacteriano. después de 10-30 minutos, el suero que no haya reaccionado se elimina mediante lavado, tratándose a continuación con globulina anticonejo fluorescente. las células bacterianas que hayan reaccionado con el antisuero, estarán revestidas con el anticuerpo (globulina) de conejo, y en consecuencia, reaccionarán con la globulina anticonejo marcada, de tal manera que se pueden identificar por la fluorescencia.

cuando es preciso detectar el antígeno, la elección entre estos métodos, están en parte determinada por el número de microorganismos diferentes, que hayan de ser identificados en la muestra, por ejemplo, los corpúsculos rábicos cerebrales sólo tienen un antígeno, y en consecuencia, se debe emplear el método directo. los virus respiratorios de las secreciones tienen muchos antígenos, por lo que estaría más indicado el método indirecto, ya que, si no se hace así, sería preciso conjugar cada suero. si todos los antisueros empleados, en los métodos indirectos, se obtienen en el mismo huésped, únicamente será necesario un conjugado antiespecie. El método indirecto es más sensible que el directo porque tiene mayor número de sitios para que se produzca la combinación, al mismo tiempo que, permite la identificación de anticuerpos específicos. el isotiocianato de fluoresceína es el conjugado más empleado, presenta una banda de adsorción primaria de 495nm y produce la emisión verde a un máximo de 520nm.

PROCEDIMIENTO

• Elaborar el protocolo de trabajo

• Asignar un casillero para cada suero por evaluar y anotar en él su código.

• En cada corrida se debe incluir el control positivo (cp), control negativo (cn) control interno para ifi (ci) y control de reactivos o blanco (b).a) retirar del congelador las láminas ifi fijadas con trypanosomas y dejarlas secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador

• En una placa para micro titulación, realizar la dilución 1/32 de cada suero y de los controles. para ello, dispensar en cada pozo 155µl de buffer diluyente y 5µl de cada suero por evaluar

• Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la micropipeta varias veces, luego siguiendo el protocolo elaborado, dis-pensar 15 ul de la dilución 1/32 de cada suero sobre el área del círculo correspondiente

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