Método de detección de proteínas

Métodos de detección de proteínas

*Lo más difícil y crítico es la fijación.

*Variabilidad en forma y función de las proteínas las hacen difíciles de detectar.

*Aminoácidos: grupos terminales NH2 y COOH

Solubilidad de proteínas:

• Proteínas polares🡪hidrofilicas (por los aminoácidos)🡪colorantes se preparan en medio acuoso
• Proteínas apolares🡪hidrofobicas🡪 desparafinacion hasta OH 70🡪colorantes se preparan en alcohol

Carga eléctrica:

• Básica🡪se debe colorear en acido
• Acida🡪se debe colorear en básico

*Identificar proteínas por grupos específicos: uso de bloqueos

*Acetilación: bloquea grupos amino e hidroxilo

*Desaminacion: perdida del grupo amino y generación de un grupo aldehído (aminos que están cerca de un grupo carboxilo o metilo)+ OH 70)

Métodos:

• Proteínas en general (para diferenciarlas de otra molécula)🡪Ej: amiloide (residuos proteicos acumulados patológicamente)
• Por solubilidad
• Por carga🡪con colorantes ácidos o acidofilia total
• Identificación de grupos NH2🡪Ninhidrina (mecanismo de acción desaminacion oxidativa)
• Identificación de grupos específicos dentro de las proteínas

*Identificación de histonas (básica) definiendo su punto isoeléctrico

Schiff:

• Fucsina básica (CI: 42510): cromoforo+ metabisulfito se transforma en un leucocolorante, al agregar HCl se conserva en estado acido y se impide que se re oxide
• HCl
• Metabisulfito

*Azocopulacion: unión de un colorante azoico

IHQ

*Utilización de anticuerpos marcados para la localización de antígenos celulares y tisulares in situ.

*Visualización con un sistema de detección apropiado y luego un sistema de revelado.

*Método que permite identificar proteínas basándose en una reacción natural tejido-anticuerpo

Carácter de antigenicidad de una proteína:

• Peso molecular (sobre 10 kilodalton)
• Presencia de radicales químicos aromáticos (anillo bencénico), ácidos o básicos.
• Estructuras conformacionales definidas (tipos de aminoácidos,  ubicación y linealidad)

Inmunidad natural🡪barreras físicas/ Inmunidad adquirida.

Fijación: considerar estructura de la molécula de antígeno; conocer el mecanismo de acción del fijador en particular. La fijación enmascara proteínas (antígenos).

El mejor fijador es el OH o cualquiera de base alcohólica.

Mejor resultado🡪tejido fresco  congelado.

1991🡪recuperación antigénica mediada por calor (antes de eso no se recuperaban y se obtenían resultados poco fiables)

Biomoléculas con capacidad antigénica:

• Proteínas (son las más comunes)
• Carbohidratos
• Ácidos nucleicos (denaturados) + P
• Lípidos complejos🡪glicolipidos
• Lipoproteinas

Constituyentes celulares identificables con métodos ICQ/IHQ (antígenos):

• Hormonas o proteínas relacionadas
• Receptores (hormonales)
• Citoesqueleto
• Proteínas de superficie en leucocitos
• Enzimas
• Antígenos de grupos sanguíneos
• Proteínas oncofetales
• Proteínas microbianas, parasitarias
• Cualquier proteína que pueda generar anticuerpos

Condiciones para IHQ:

• Preservación del antígeno en el contexto tisular (fijación)
• Localización sin difusión. Insolubilización del antígeno y disponibilidad para su reacción con el anticuerpo.
• Tinciones específicas y sensibles🡪detectar cantidades pequeñas de molécula

*Un anticuerpo es otra proteína🡪 Ig (deriva de las células plasmáticas y éstas del linfocito B). Proteína capaz de reconocer un antígeno de manera específica (IgA, IgE, IgG, IgD, IgM). Proteína presente en el suero, secreciones e intersticio tisular animal. Principalmente gammaglobulinas. La unión del anticuerpo especifico con el antígeno forma un “complejo inmune”. Está formado por dos cadenas pesadas (clase de Ig) y dos livianas (kappa y lambda) unidas por puentes disulfuro (no covalente). Ambas cadenas poseen grupos terminales NH2 y COOH. La región que reconoce un antígeno es el paratopo (dentro de él está la región VDJ); la región reconocida por un antígeno es el epitopo.

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