PRÁCTICA 3: COCOS GRAM POSITIVOS

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“FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS”

 MATERIA: LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA

 “PRÁCTICA 3: COCOS GRAM POSITIVOS”

Dra. Patricia Segura Ceniceros.

Equipo: Juan Carlos Romero Cabello.

    #1      Isaac Corvera García.

               Rodolfo Salvador Segoviano Glez.

               Herwin Daniel López Rodríguez.

               Abrahan Josué Cerda Saucedo.

SEMESTRE ENE-JUN

FEBRERO-2018

PRÁCTICA 3: COCOS GRAM POSITIVOS

OBJETIVO:

Aprender a aislar e identificar los cocos gran positivos.

INTRODUCCIÓN:

El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal, incluyendo estreptococos, estafilococos, neiserias, difteroides, levaduras y bacilos entéricos Gramnegativos. Los cocos grampositivos patógenos se aíslan en agar enriquecido y suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan capacidad hemolítica, parcial (alfa hemólisis) o total (beta hemólisis) El género Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus propiedades microscópicas, morfológicas coloniales y bioquímicas. S. aureus es el único coagulasa positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con pigmentación amarilla si se incuba a temperatura ambiente y es beta hemolítico. Es muy resistente a la acción del calor, luz, desecación, temperaturas extremas, agentes químicos, sobrevive semanas o meses en el polvo, pus o esputo. Es altamente tolerante a altas concentraciones de sales, sobreviviendo en alimentos preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina. A diferencia de aquél, S. epidermidis es coagulasa negativo, no-hemolítico. Antigénicamente, los estreptococos presentan 13 grupos (clasificación de Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y son denomminados de la A a la O. Los estreptococos del grupo A, también denominados Streptococcus pyogenes constituyen la causa más común de faringitis en humanos. Al crecer en medio de cultivo forman colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta hemolíticas y son los más virulentos. La proteína M es el principal antígeno en las cepas virulentas. Son sensibles a la Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o pus. Los estreptococos del grupo B incluyen a S. agalatiae y dan la prueba de CAMP positiva: una hemólisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unión de su crecimiento con S. aureus. Streptococcus faecalis (gpo. D) es el único que crece en EMB. El Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas en condiciones aerobias y beta hemolíticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan colonias mucoides debido a que presentan una gran cápsula, lo que constituye su factor de virulencia. Es difícil de mantener en las resiembras. Es sensible a la Optoquina.

 MATERIALES Y MÉTODOS:

• Aislamiento e identificación de cocos gran-positivos

1. Tome un exudado faríngeo de un compañero con un hisopo estéril en la forma tradicional y deposite la muestra en el extremo de una placa de agar sangre. Extienda el inoculo con un asa por estría cruzada. Incube a 37 C por 24 hs.
2. El resto de la muestra que quedó en el hisopo deposítelo en un portaobjetos y haga un frotis. Tiña con gran. .
3. Determine en todas las placas sembradas, cuáles colonias produjeron hemólisis y de qué tipo. 4. Haga un gran de las colonias del exudado.
4. Para la cepa control de S. aureus y las colonias semejantes a S. aureus o a Staphylococcus sp., desarrolladas del exudado faríngeo, haga la siguientes pruebas:

1. Prueba de la catalasa: tome una colonia bien aislada con el asa estéril y sumérjala en una gota de agua oxigenada. Observe una efervescencia por desprendimiento del O2.
2. Prueba de la coagulasa: Con el asa estéril obtenga una colonia beta hemolítica bien aislada y mézclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el resultado. Si hay coagulación del plasma, es coagulasa positivo.
3. Cultivo en medio sal-manitol. Tome con el asa estéril una colonia bien aislada, beta hemolítica y siémbrela en una placa de sal-manitol-agar por estría cruzada. Incube a 37 C durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color dorado y el cambio de color del medio a amarillo. Esto, debido a la fermentación de la lactosa y acidificación.

1. Para S. pyogenes (estreptococos del gpo. A) y en las colonias semejantes del exudado, determine su sensibilidad a la Bacitracina. Para ello siembre una colonia bien aislada en la mitad de una placa de agar-sangre y coloque un círculo de papel filtro impregnado con Bacitracina
2. En el otro sector de la caja, coloque que un círculo impregnado con Trimetroprin para determinar su resistencia. Incube a 37 C por 24 hs. Determine el diámetro del halo de inhibición alrededor de cada antibiótico para determinar la sensibilidad.
3. Para la identificación del estreptococo beta hemolítico del gpo. B (Streptococcus agalactiae), realice la prueba de CAMP, en la forma siguiente: - Tome una colonia beta hemolítica con el asa y siémbrela en una sola línea perpendicular a otra línea previamente sembrada con S. aureus. Incube a 37C durante 24 hs. Determine si hubo hemólisis en forma de punta de flecha, unen las dos bacterias.
4. Para identificar S. pneumoniae, practique en las colonias semejantes al control positivo la prueba de la optoquina, colocando un círculo de papel impregnado con el antibiótico en un medio con agar-sangre donde se sembró la bacteria. Incube a 37 C por 24 hs. Mida el halo de inhibición para determinar la sensibilidad.

OBSERVACIONES:

1. Se llevo a cabo un exudado faríngeo con hisopos estériles a partir de dos compañeros de laboratorio y de los cuales a partir de esto se comenzaron a realizar las pruebas.
2. Ambos exudados faríngeos (tomados de los compañeros Rodolfo y Abrahan)  se sembraron en una placa de agar sangra, en ambas se obtuvo una muy pequeña hemolisis, apenas apreciables.
3. Se resembraron los cocos obtenidos en placas de agar sangra esperando los resultados de las pruebas bioquímicas.
4. En los frotis inciales (los que se hicieron con la muestra sobrante del exudado) se encontraron cocos gram negativos organizados en cadena en ambos casos.
5. En la segunda parte de la práctica, se realizaron las pruebas bioquímicas para determinar el grupo y la especie de los cocos estudiados.
6. Se observo en una segunda ocasión al microscopio, esta vez se encontraron en el primer cultivo (del exudado faríngeo tomado del compañero Rodolfo) bacilos gram negativos agrupados en cadena, en el segundo de los cultivos (a partir del compañero Abrahan) se encontraron cocos gram positivos organizados en cadena.
7. En la prueba de la catalasa esta salió positiva para el segundo de los cultivos (compañero Abrahan) y también para el cultivo a partir de la muestra de clara de huevo, mientras que para el primero dio negativa debido a que eran bacilos.
8. En la prueba de la coagulasa esta dio negativa en todos los casos.
9. En la prueba de CAMP esta también resulto negativa en la muestra a partir del compañero Abrahan e igualmente negativa para la muestra a partir de la clara de huevo.
10. No se realizaron las pruebas que requerían papel filtro o antibiótico debido a que los fármacos utilizados contenían diversas sales que afectaban el resultado.

• Frotis realizado con lo que sobro del primer exudado faríngeo (antes de cultivar)

• Frotis Realizado después de las 24 hrs. De cultivo

RESULTADOS:

• Prueba de la Catalasa

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