PRÁCTICA NO. 2 HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN POR AMILASA

PRÁCTICA NO. 2
HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN POR AMILASA

María Fernanda López Cano1 (201214314)[pic 1]

1Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala, Carrera de Nutrición

INTRODUCCIÓN:

        El almidón es un polisacárido de la dieta de origen vegetal, compuesto por amilosa y amilopectina. La enzima a-amilasa actúa sobre el almidón hidrolizando al azar enlaces a(1→4). La amilopectina por ser ramificada contiene enlaces a(1→6) que  la a-amilasa no puede hidrolizar por lo que el resultado es una mezcla de oligosacáridos ramificados y no ramificados llamados dextrinas (Nelson, D.L. y Cox, M.M. 2009).  Los productos de la hidrólisis enzimática son glucosa, maltosa y dextrinas límites. En esta práctica se dio a conocer el efecto de la amilasa sobre el almidón con variables como el tiempo y la temperatura, también se utilizó la metodología Somogyi y Nelson para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados por la acción de la enzima a-amilasa en el hongo del género Aspergillus orizae. En estas reacciones de Somogyi y Nelson, el producto es un compuesto color azul intenso que se midió en el espectrofotómetro a 630nm.

METODOLOGIA:

        El reactivo cúprico de Somogyi actúa sobre la glucosa, que por ser un azúcar reductor, reduce el ión cúprico a ión cuproso en medio alcalino caliente. Los iones cuprosos, al reaccionar con el reactivo de arsenomolibdato, el molibdeno hexavalente se reduce y toma un intenso color azul. En la reacción colorimétrica se midió la intensidad de la coloración por las reacciones de Somogyi y Nelson (Beyer, W. 1986). La Espectrofotometría  se refiere a los métodos cuantitativos, de análisis químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas. Una reacción colorimétrica es aquella en que el producto de la reacción es una molécula que, al modificar su estructura química durante la reacción, genera una molécula que presenta un color (Beyer, W. 1986).

RESULTADOS:

Gráfica # 1:

“Curva de Calibración”

[pic 2]

Fuente: Datos experimentales, obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12, USAC.

En la gráfica # 1 se observa la estandarización de la glucosa por medio de una curva estándar, esto se realizó con el fin de calcular cualquier concentración de producto liberado o de sitios reductores detectados.

Gráfica # 2: “Muestras problemas”.

[pic 3]

En la gráfica #2 se observa que en el tiempo 5 estuvo el mayor sitio reductor liberado por la enzima.

Fuente: Datos experimentales, obtenidos en el laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12, USAC.                                                    

DISCUSIÓN  

Se realizó la  estandarización de la glucosa por medio de una curva estándar, con el fin de calcular cualquier concentración de producto liberado. Se utilizó como blanco el tubo 1 para poder calibrar el espectrofotómetro debido a que este no contiene sustrato (Ver gráfica No.1).

La a-amilasa cataliza la hidrólisis de enlaces glucosídicos a(1→4) de la amilosa y amilopectina produciendo a-dextrinas, a-maltosas y a-glucosas (Nelson, D.L. y Cox, M.M. 2009).   Para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados por la acción de la enzima a-amilasa presente en Aspergiullus orizae, se utilizó la metodología de Somogyi y Nelson. Inicialmente, se agregó amilasa al almidón y se sometió a calor, esto para conocer el efecto que la amilasa tuvo sobre el almidón. Al tomarse distintas alícuotas en tiempos 5, 10, 20, 30 minutos, la amilasa fue hidrolizando al almidón y se obtuvo cierta cantidad de sitios reductores.

Para determinar esta cantidad de sitios reductores se agregó el reactivo cúprico de Somogyi, que redujo el ión cúprico a ión cuproso, se sometió a calor y por 20 minutos hizo que la a-amilasa detuviera la acción (ver imagen 1, Anexos). Al agregar arsenomolibdato el Mo4+ se  reduce a Mo2+, y Cu+ se oxida a Cu2+ dando la coloración azúl (Ver imagen 2, Anexos). Al aumentar el color, se determinó la concentración de la cantidad de sitios reductores liberados, por el espectrofotómetro. En el minuto 5, se obtuvo la mayor liberación de sitios reductores (Ver gráfica No. 2).

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