PRACTICA 6: Cuantificación de ADN por espectrofotometría

UAp: BIOLOGÍA MOLECULAR

PRACTICA 6: Cuantificación de ADN por espectrofotometría

COMPETENCIA: Determinar la concentración de ADN de una muestra conocida a partir de la absorbancia de 260 nm.

MARCO DE REFERENCIA

La espectrofotometría UV/Visible nos permite confirmar que contamos con cantidad suficiente de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de calidad adecuada antes de llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR), análisis de SNPS (Polimorfismos de nucleótido único) o la secuenciación automática de muestras de DNA de plásmidos, cósmicos, productos de PCR, etc.

La espectrofotometría es usada para identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de un material o sustancia, esto último nos permite conocer la concentración de compuestos, seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas así como determinar enzima y proteínas incluso ácidos nucleicos. Un espectrofotómetro es un equipo de laboratorio que mide la cantidad de luz que pasa por medio de una longitud de onda específica. La cantidad de luz absorbida por un medio es proporcional a la concentración del soluto presente, es entonces así que la concentración de un soluto colorido en solución puede ser determinada en el laboratorio mediante la medición de su absorción de luz a una longitud de onda específica. Las muestras en estos equipos se utilizan en estado líquido y se colocan en el compartimiento de las muestras de celdas transparentes de diferentes tamaños y materiales.

MATERIALES Y  MÉTODOS

EQUIPO

Espectrofotómetro

Pipetas automáticas de 2.0-20µl y de 100-1000µl

Puntas amarillas

Puntas azules

Cubetas de cuarzo

MATERIALES

Tubos eppendorf de 1.5 ml

Piceta con agua bidestilada

Agua bidestilada

Muestra conocida de ADN

Hielo

Toallas de papel

Calculadora

PROCEDIMIENTO:

[pic 1]

PRECAUCIONES Y  MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD.

El equipo debe estar ubicado en una superficie plana lejos de cualquier campo eléctrico o magnético, de cualquier dispositivo eléctrico que pueda generar campos de alta frecuencia y donde esté libre de polvo, gases corrosivos y fuentes vibratorias.

Evitar que se obstruya el flujo de aire por debajo, atrás o alrededor del instrumento.

El proceso de encendido tarda alrededor de 2 minutos y debe de calentarse 30 minutos antes de usarse.

Seguridad e higiene:

Es obligatorio el uso de equipos de protección individual como:

• Guantes de protección para productos químicos
• Protección facial
• Bata.

RESULTADOS:

Después de realizar la espectrofotometría de la muestra, esta arrojo una absorbancia de 0.96.

Sabemos que en 1ml hay 50ug/ul entonces en nuestra muestra se encontró una cantidad total de 48ng/uL. De ADN[pic 2]

CONCLUSIÓN:

Gracias a esta práctica fue posible determinar la concentración de ADN de la muestra en estudio utilizando el fundamento de la espectrofotometría para conocer su absorbancia a 260 nm. Debido a las observaciones, particularmente cualquier modificación hasta las más pequeñas durante los pasos de este procedimiento de extracción es importante ya que necesitamos saber el valor de la pureza que está presente en la molécula. El cuidado con que el ADN genómico es importante para fines de aprendizaje. Se realizó la cuantificación de ADN por espectrofotometría, para lo cual, dicha práctica resultó satisfactoria en tiempo y forma.

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