PREPARACIÓN HISTOLÓGICA Técnicas para obtener preparados

PREPARACIÓN HISTOLÓGICA

Técnicas para obtener preparados:

Los preparados son generalmente analizados al microscopio óptico (95% de los casos) mientras que sólo un 5% de ellos son observados en microscopía electrónica (o de barrido o de transmisión).

Fijación de la muestra:

Implica fotografiar el tejido en cuestión para que permanezca al igual que en el organismo. Se pretende preservar el material a ser analizado de manera que pueda trabajarse en las condiciones iniciales. Mediante la fijación se intenta evitar el efecto mórbido de la muestra.

El fijador universal es el formaldehido, formol al 15%. Esta sustancia permite realizar gran mayoría de las técnicas de coloración pero no todas. Destruye el nivel sub-celular de manera que para microscopia electrónica no es bueno.

Otro fijador es el BOUIN  es un fijador nuclear. Es de color amarillo y más suave que el formol. Es mucho mas especifico y se emplea, por ejemplo, cuando se interesa el análisis de núcleos.

El glutaraldehído es el fijador por excelencia para microscopia electrónica. Es mucho más suave que los anteriores y no destruye el nivel sub-celular generalmente se lo encuentra preparado al 4% o 5%.

Los materiales, por ende, pueden tener dos destinos: ser analizados en ME, para lo cual se utiliza glutaraldehído o ser observados en MO para lo cual se utiliza formol.

Fijación por congelado:

La muestra se coloca en isopentanoy es enfriada en un medio de nitrógeno liquido (-160 ºC) el isopentano congela alrededor de -80 ºC.

Se coloca la muestra en un recipiente de plástico que es llevado a otro recipiente de acero que contiene isopentano. Este último se coloca en un freezer que contiene nitrógeno líquido. Es importante preservar la cadena de frío.

Fijación in vivo:

Se realiza mediante el uso de anhídrido carbónico. Durante una operación, el órgano en cuestión es congelado por aplicación directa de CO2 mismo momento en que la muestra es tomada y llevada a analizar.

Preparado:

[pic 1]

Condiciones de la muestra:

• Material muy delgado, que permita el pasaje de luz.
• Coloreado que posibilte ver las distintas estructuras.
• El proceso de fijación dura aproximadamente 30 minutos.

SIGUIENTES PASOS:

1. Extracción y fijación.
2. Selección de la parte a estudiar.
3. Deshidratación.
4. Aclaración.
5. Creación del soporte.
6. Corte (micrótomo).
7. Coloración.

Para la deshidratación es necesaria la aplicación de un “alcohol deshidratante”. La muestra es sometida a distintas soluciones que van aumentando paulatinamente de concentración.

El aclaramiento de la muestra consiste en quitar el deshidratante y agregar un compuesto que pueda ocupar su lugar. Se agregan entonces: xylol(xileno: es el más frecuente utilizado), tolueno (toluol) o benceno (benzol).

La creación del soporte implica la inclusión de la muestra ya deshidratada y aclarada en parafina (tiene que encontrarse en estado líquido para lo cual es llevada a una temperatura de 50ºC aproximadamente y mantenida allí con una estufa). Se produce la salida de xilol y la entrada de la parafina.  Se requiere una hora de inmersión.

La muestra es retirada del medio con parafina, se deja enfriar para que quede constituido el soporte.

El micrótomo es un aparato con la capacidad de realizar numerosos cortes micrométricos a una misma muestra. Se utiliza un ultra-micrótomo para microscopía electrónica. Este realiza cortes ultra-finos (2 micrómetros).

Cuando se realizan técnicas en fresco o de congelación se corta en un criostato. Su principal ventaja es que permite mantener tanto la estructura como la función del tejido (permite mantener cadenas enzimáticas).

Luego de haber cortado se coloca al material en un porta-objetos. Para colorearlo es necesario realizar el proceso inverso: retirar la parafina agregando xilol, aplicar hidratantes y colocar agua.

Si se hubiese usado glutaraldehido, para deshidratar la muestra, en vez de alcohol, se debe emplear ACETONA y en vez de parafina para el soporte, se endurece con ARALDITA o bien se realiza una inclusión en plástico. La araldita es un compuesto mucho más duro q la parafina que permite cortes en Å.

Tinción del material:

Un material puede ser teñido de tres maneras diferentes: tinciones enzimáticas, tinciones inmunohistoquímicas y tinciones histoquímicas.

• Histoquímicas:

1. H/E (HEMATOXILINA-EOSINA): este método produce la tinción de los componentes de la muestra por atracción basófila o acidófila. La bosofilia implica una coloración en negro (gris, negro, lila). Son muy basófilos los núcleos (alta cantidad de ácidos nucleicos). En contraparte, lo eosinófilo adquiere color rojo o rosa.[pic 2]
2. TRICRÓMICO DE MASSON: su nombre radica en los tres colores diferentes que otorga al diferenciar estructuras. “siempre que se vea color azul o turquesa hay que pensar en esta técnica”. (núcleos oscuros, epitelios y músculos rojos, conjuntivo o conectivo azul o turquesa).   [pic 3]
3. P.A.S (PERIODIC ACID SCHIFF): es una técnica específica para teñir glúcidos de rojo. Todo aquello que no sea de carácter glucídico no se teñirá para lo que previamente se realiza un fondo de H/E.[pic 4]
4. O.R.O (OIL RED O): es una técnica específica para la tinción de lípidos. Sustancia grasa. Se colorean de color naranja.[pic 5]
5. IMPREGNACIÓN ARGENTICA: sirve para la coloración de células y fibras reticulares. Se produce la impregnación con plata dando como color positivo al negro.[pic 6]
6. ROJO CONGO: sirve para teñir material amiloide y su color positivo es el anaranjado. Para saber si es realmente amiloide se expone bajo luz polarizada y si es positivo tiene que dar color verde manzana.

[pic 7]

[pic 8]

• Inmunohistoquímicas: basada en la producción de reacciones inmunológicas para detectar estructuras tisulares. Existe un compuesto llamado revelador DAB que tiñe color marrón a lo positivo.

Aunque la mayoría son fijadas en formol y luego parafina, es necesario en algunos casos que la muestra esté fijada como material en fresco.Utiliza un filamento intermedio como antígeno.

• Enzimáticas: necesitan que se trabaje con material en fresco. Se realizan cortes semi-finos que son tejidos con azul de toluidina, por ejemplo. Otra posibilidad radica en utilizar PPD (parapfenildiamina). El osmio es utilizado en cortes ultra-finos, permite el estudio sub-celular. También se utiliza NADH, SDH, ATPasas y COX.

EPITELIO

Los epitelios son tejidos que revisten superficies y cavidades. (ej: aquél que reviste la cavidad pleural o aquel que recubre la cara interna de todo el aparato respiratorio). Forman barreras que dependiendo del epitelio pueden ser impermeables y/o selectivas (según el tamaño y la carga de la sustancia transportada). Protección, secreción y absorciónson otras de sus funciones. Tiene permeabilidad selectiva al poseer receptores específicos en su dominio apical. Pueden ser semipermeables como el caso del riñón para producir orina. Permiten el transporte de sustancias a través del intracelular.

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