PRUEBAS ESTUDIOS INDIRECTOS PARA PRUEBAS INMUNOLOGICAS

ARTICULO O LIBRO: ESTUDIOS INDIRECTOS PARA PRUEBAS INMUNOLOGICAS

CONTENIDO:

 DEFINICIÓN: El apoyo por el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes consiste en un gran número de técnicas que permiten tanto identificar como confirmar el o los antígeno(s) específicos reconocidos. Además, este tipo de técnicas han evolucionado de manera importante en las últimas décadas, ya que se han desarrollado pruebas con mayor especificidad y sensibilidad. Entre las técnicas más utilizadas se encuentran: la inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ensayo inmunoenzimático (ELISA), el ensayo múltiple y la electroinmunotransferencia (EIT). Utilización de antígenos específicos para detectar anticuerpos. (diagnostico indirecto).

Inmunofluorescencia indirecta:

La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las técnicas más utilizadas en los estudios de autoinmunidad debido a su fácil manejo y estandarización. La técnica se basa en el reconocimiento de los anticuerpos que reconocen estructuras antigénicas celulares nativas. La interacción se evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana, producido en conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones constantes (Fc) de las inmunoglobulinas IgG, IgA y/o IgM. Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano esta ́ conjugado o acoplado a un fluoróforo (generalmente isotiocianato de fluoresceína [FITC]). Los resultados del reconocimiento de los antígenos por los autoanticuerpos presentes en el suero, plasma o cualquier otro líquido, se evalúan en un microscopio de epifluorescencia. Actualmente, la IFI se utiliza en los estudios de autoinmunidad para la detección de anticuerpos anti-DNA de doble cadena (DNAcd) o DNA nativo (DNAn) utilizando como sustrato Crithidia luciliae. Para la detección de anticuerpos que reconocen antígenos nucleares se utilizan como sustratos líneas celulares epiteliales humanas como las células HEp-2 o las células HeLa. En el caso de los anticuerpos contra componentes de los gránulos primarios y específicos de los polimorfo nucleares o anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), se utilizan neutrófilos fijados con etanol y formalina; y para los anticuerpos que reconocen antígenos órgano-específicos, se utilizan como sustratos cortes de tejidos específicos (v. g. tiroides, esófago, estómago, glándulas suprarrenales, glándulas salivales, etc.).

Uso: prueba suplementaria para confirmar infección

Por VIH-1

Detección de anticuerpos antiI-DNAn con Crithidia luciliae como sustrato:

El ensayo se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos que reaccionan contra el DNAn de la mitocondria gigante (cinetoplasto) del parásito Crithidia luciliae. La prueba solo se considera positiva cuando se tiñe el cinetoplasto independientemente de la tinción en el núcleo, debido a que en el núcleo puede existir reactividad contra otros componentes, lo que da resultados falsos positivos. La técnica es altamente específica, pero poco sensible, por lo que es conveniente en ciertos casos confirmar los resultados con otras pruebas más sensibles como el ELISA.

Anticuerpos antinucleares

La identificación y cuantificación de los anticuerpos anti- nucleares (ANA) no solo incluye antígenos que se localizan en el núcleo de células HEp-2, sino también antígenos del citoplasma. La importancia de usar células HEp-2 como sustrato se fundamenta principalmente en que tienen un núcleo más grande de lo normal debido a su gran cantidad de antígenos nucleares (más de 46 cromosomas, más de 3 nucléolos, abundantes ribonucleoproteínas, etc.) y citoplásmicos (mitocondrias, lisosomas, ribosomas, etc.) lo que permite hacer una fácil detección e identificación de los antígenos reconocidos por los auto- anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Además, por ser una línea celular muy activa, se pueden observar todas las fases del ciclo celular en los cultivos, con lo que se facilita la identificación de antígenos presentes solo en las fases de división, como los centrómeros o aquellos conocidos como proliferating cell nuclear antigens (PCNA) La detección de ANA mediante IFI utilizando como sustrato células HEp-2 es útil como prueba de tamizado inicial, debido a que los patrones de tinción más comunes se relacionan con una gran variedad de antígenos, sin embargo, resulta necesario realizar pruebas más sensibles y específicas como el ELISA para identificar el antígeno o antígenos reconocidos por los auto anticuerpos. También se pueden observar patrones de tinción específicos para antígenos, como: proteínas de la lámina nuclear, centriolos, Jo-1yScl-70, en cuyos casos el patrón observado es de gran utilidad para identificar específicamente al antígeno reconocido, el cual puede ser confirmado mediante ELISA o EIT.

Uso: diagnóstico de lupus eritematoso sistémico, el síndrome Sjögren, la esclerodermia, la polimiositis, la enfermedad mixta del tejido conectivo y la artritis reumatoide, etc.

Anticuerpos anticitoplasma del neutrófilo

Para la detección de los ANCA, la IFI se utiliza también como prueba de tamizado inicial, debido a que en ella se observan los 3 patrones de tinción que se relacionan con manifestaciones clínicas de autoinmunidad. Los patrones son: el citoplásmicos o cANCA, el perinuclear o pANCA y el atípico o xANCA. El patrón cANCA se caracteriza por presentar una tinción citoplasma en neutrófilos fijados con etanol o acetona. Los anticuerpos que dan el patrón cANCA reconocen proteínas débilmente catiónicas o neutras como laproteinasa-3 (PR-3) y la proteína catiónica de 57kDa (CAP-57), las cuales se liberan de los gránulos específicos por el tratamiento de las células con alcohol o acetona y se distribuyen de manera homogénea en el citoplasma de los neutrófilos. El patrón pANCA se observa en neutrófilos fijados con etanol o acetona y es perinuclear homogéneo. El patrón está dado por los anticuerpos que reconocen proteínas fuertemente catiónicas como: mieloperoxidasa (MPO), elastasa y azurocidina, las cuales cuando son liberadas de los gránulos primarios y específicos del neutrófilo se reorganizan en la periferia del núcleo, el cual tiene carga negativa por el DNA (fig. 2A). El patrón pANCA se debe confirmar en neutrófilos fijados con formalina. La formalina es un solvente orgánico que reduce el efecto de atracción de las proteínas catiónicas (MPO, elastasa y azurocidina) hacia el DNA, con lo que quedan distribuidas en el citoplasma. Los

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