Practica N°12: CROMATOGRAFIA DE AMINOACIDOS

Practica N°12:

CROMATOGRAFIA DE AMINOACIDOS

MARCO TEORICO:

El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases). Todas las técnicas intentan explotar las diferencias físicas, químicas y biológicas de las distintas biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento. Entre dichas propiedades podríamos citar:

• Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgánicos como acuosos.
• Diferencias en tamaño y forma.
• Diferencias en carga.
• Diferencias en afinidad por otras biomoléculas.

Todas estas propiedades y, por tanto, la separación de diferentes compuestos están influenciadas por las condiciones del medio de separación, pH, temperatura, fuerza iónica e hidrofobicidad. De forma general, en las técnicas cromatográficas existe una distribución de las moléculas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase móvil que circula sobre la fase estacionaria en íntimo contacto con ésta.

OBJETIVOS:

• Comprender los principios básicos de la cromatografía como herramienta útil en la identificación y separación de compuestos.
• Separar e identificar los aminoácidos presentes en una muestra.
• Conocer la importancia de la ninhidrina en la dactiloscopia.
• Enfatizar en el proceso enseñanza-aprendizaje valores de puntualidad, responsabilidad, cooperación y perseverancia.

MATERIALES

• Reactivos:

• Solución de aminoácidos 0.1 M.
• Solución de ninhidrina (al 2% en acetona).
• Etanol.
• Ácido acético.

• Material de vidrio:

• Beakers, 250 mL.
• Capilares.
• Pipetas, 1 y 10 mL.
• Placas petri.

• Otros:

• Placas de TLC.

• Equipos:

• Cocinilla eléctrica.

PROCEDIMIENTO

1. Primero en la placa de silicagel se marcan bordes de 0.5 cm en la parte superior e inferior. Luego en la parte inferior de la placa se hacen 4 puntos equidistantes para colocar ahí nuestra muestra.

NOTA: No tocar directamente la placa; puede que se queden impregnadas huellas que interfieran en el desarrollo, siempre sujetar de los bordes.

1. Acto seguido se preparan los capilares para colocar o “sembrar” las muestras, para lo cual se calientan los capilares directamente al mechero con cuidado, y luego cuando este lo suficientemente caliente se divide haciendo que se formen puntas sumamente delgadas.

1. Luego se siembran las muestras en este orden:

1. Glicina
2. Metionina
3. Arginina
4. Sol. Problema

No siembre poco, ni agregue demasiada muestra. Para lograr realizar todo con normalidad se debe de colocar un término medio.

1. FASE MOVIL: se prepara etanol / ácido acético  (9:1) en un beaker del tamaño adecuado para el experimento.

1. Se deposita la fase estacionaria y la fase móvil en el beaker, es decir la placa de silicagel junto a la solución de etanol/ ácido acético. De inmediato se coloca una tapa de placa Petri

1.  Luego se va a observar la corrida cromatografía, se notara una diferencia de color como una columna de agua subiendo.

1. Cuando se ve que la columna de agua llega a la línea que marcamos en la superficie se retira la placa y se deja secar a temperatura ambiente.

1. Para poder visualizar las sustancias es necesario agregar un revelador, en este caso la ninhidrina y la dejamos secar a temperatura ambiente.

1. Luego de secar llevamos la placa a una plancha caliente como la hornilla. Los aminoácidos tomaran un color azul o purpura. Se debe de marcar el centro de esta mancha.

1. Ahora se debe de calcular el factor de retención (Rf) para cada aminoácido utilizado con la siguiente ecuación.

[pic 1]

1. Con los datos obtenidos se puede averiguar qué clase de aminoácidos tiene nuestra muestra problema. 

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SUGERENCIAS

• Se debe de tener cuidado al manipular los capilares al manipularlos en el mechero, pueden ocurrir accidentes.
• Se debe de tener cuidado al momento de manipular las placas, ya que en varios casos la placa se vio manchada con huellas dactilares, impidiendo distinguir con claridad la mancha cromatografica.
• Se debe de medir la cantidad de muestra que se está colocando, en muchos casos fue insuficiente.
• Y tener paciencia en todo el desarrollo,  cada proceso tiene un tiempo prolongado y muchos grupos no tomaron en cuenta esto, haciendo que su resultado no sea óptimo.

CONCLUSIONES

• La práctica se realizó con normalidad y se pudo comprender el fundamento de la cromatografía en aminoácidos.
• Se realizaron cálculos para determinar el factor de retención de cada aminoácido y compararlos con los demás (ver anexo 1). Se dio el resultado que la solución problema tenia metionina.
• Este tipo de cromatografía sería muy útil al momento de realizar identificaciones en crímenes. Ya que como se mencionó el tipo de aminoácido de cada persona es casi único, lo que podría ayudar a la identificación de personas casi tan eficiente como el ADN.

CUESTIONARIO

¿Cuál es el rol del adsorbente en la TLC?

El adsorbente en la TLC hace que se logre distinguir que tipo de compuestos estamos observando, y la interacción que hay entre estos y la TLC en si. Dependiendo de la capacidad de adsorber de la solución se puede aclarar la composición de este.  (Universidad Autonoma de Madrid, s.f.)

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