Principios de análisis y uso actual

Principios de análisis y uso actual

La medición de la actividad de la lipasa sérica ha sido durante mucho tiempo reconocido como útil para el diagnóstico de la pancreatitis. Desafortunadamente, los primeros métodos estaban plagados de dificultades técnicas, por lo que la medición de la enzima era problemática y su utilidad clínica poco fiable. Sin embargo, los avances en nuestra comprensión de la acción de la lipasa ha mejorado en gran medida la fiabilidad de las mediciones de lipasa y, posteriormente, han mejorado la utilidad clínica de la lipasa para el diagnóstico de la pancreatitis.

Las lipasas son enzimas que hidrolizan los ésteres de glicerol de ácidos grasos de cadena larga. Actúan sobre los enlaces de glicerol (enlace éster) para liberar a dos moléculas de ácido graso y una molécula de β-monoglicérido.

Es esencial para la comprensión de la metodología de lipasa, el hecho de que la enzima actúa sólo en una interfaz éster-agua. Por lo tanto los sustratos del ensayo deben establecerse en forma de emulsiones. La velocidad de reacción aumentará con la dispersión de la emulsión (área de superficie). El hecho de no lograr una interfaz de éster-agua adecuada permitirá que la acción de enzimas no lipasas (hidrolasa de éster carboxílico, hidrolasa de éster de arilo-, y lipoproteína lipasa). El uso de sustratos de cadena corta de ácidos grasos de triglicéridos, que son solubles en agua, también permitirá esta falsa reacción de lipasa que se produzca.

Método de titulación

Los métodos de valoración fueron los primeros ensayos. Se basa en la incubación de suero durante 24 horas a 37 ° C, con una emulsión de 50% de aceite de oliva y 5% goma de acacia en un buffer de fosfato a pH 7,0. El ácido graso liberado se cuantifica a continuación mediante titulación con NaOH empleando como indicador a la fenolftaleína.

Han surgido métodos alternativos para sustituir los métodos de valoración. Por ejemplo, Tietz y Fiereck, hizo un trabajo empleando mediciones de punto final de pH metro (aparato) y un método usando un aparato de pH stat. Un desarrollo más reciente de la técnica de pH consiste en la medición de la tasa de cambio de pH cuando los ácidos grasos se liberan. Este método requiere una medición de pH muy sensible, es decir que media los cambios de pH de menos de 0,02 para los valores en el rango normal. Este procedimiento emplea aceite de oliva como sustrato, pero no utiliza los ácidos biliares o colipasa para activar lipasa. La reacción es muy rápida, alrededor de 3 minutos.

Método colorimétrico

El método de Massion y Seligson cuantifica los ácidos grasos liberados después de 1 h de incubación mediante la extracción de ellos y que les permite cambiar el color empleando un indicador de rojo de metilo (buffer).

Técnicas inmunológicas

Existen varios ensayos inmunoquímicos para la medición de la lipasa. Estos incluyen tanto los procedimientos cuantitativos de inmunoensayo de enzima y un procedimiento de aglutinación de látex semicuantitativo. Los anticuerpos para lipasa están ligados a partículas de látex, y estas partículas se mezclan con la muestra. Si está presente la lipasa , se observa aglutinación que aparecen en la platina de reacción [7].

Un procedimiento de inmunoactivación no competitivo. Este ensayo usa fragmentos Fab de anticuerpos contra la lipasa pancreática que se acoplan covalentemente a la peroxidasa de rábano picante. En la presencia de la lipasa, la peroxidasa cataliza una reacción que produce el color, lo cual es proporcional a la concentración de lipasa en la muestra.

Método acoplado enzimático espectrofotométrico

Varios ensayos enzimáticos acoplados se han desarrollado para la medición de la lipasa sérica. EL ensayo enzimático emplea un ácido graso de cadena larga micelar-solubilizado, es decir el 1,2-diglicérido. La lipasa desase (divide) el sustrato para formar 2-monoglicéridos y ácidos grasos. El 2-monoglicérido es posteriormente hidrolizado a glicerol por 2-monoglicérido lipasa (MGLP). En la etapa de reacción final, el sistema cromógeno (4-aminophenazone/N-ethyl-N- [2-hidroxi-3-sulfopropil-m-toluidina] [TOOS]) se oxida a un colorante violeta, con pico de absorción a 550 nm. La mezcla de reacción también contiene colipasa y desoxicolato.

Otro método enzimático ha sido adaptado a la tecnología de película seca. Este método emplea 1-oleil-2,3-glicerol diacetoyl adsorbido sobre las partículas de TiO2 como el sustrato. Las partículas de TiO2 actúan para proporcionar la superficie necesaria para la actividad lipasa. Además, un agente emulsionante y colipasa porcina están presentes para aumentar la actividad de la lipasa. Lipasa actuará sobre el triglicérido para liberar el ácido graso oleico y el soluble en agua (diacetoyl

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