Prueba Del Indol

20-01-2015

Tincion gram

Fundamento:

Es una tinción diferencial que basa su distinción en la estructura diferente de la pared bacteriana de las bacteria Gram + (pared más gruesa, y una sola capa de peptidoglucano ) y de las Gram- ( pared más delgada y dividida en dos partes). Como puede verse una vez finalizada la tinción las bacterias gram- estarán teñidas de un color rosáceo, y las gram+ de un color violeta. Esto sirve para diferenciarlas claramente al microscopio óptico

Materiales:

Bata

Papel de filtro

Guantes

Prortas

Microscopio óptico

Asa de siembra.

Mechero bunsen .

Placa petri .

Pipeta pasteur .

Reactivos:

- Colorante básico Cristal Violeta o Violeta de Genciana. Es el primer colorante que se echa sobre el frotis previamente preparado. Es un colorante selectivo que tiñe a todos los microorganismos

- Lugol. Producto compuesto de yodo y yoduro potásico. Es un mordiente, que intensifica al Cristal Violeta haciendo que precipite

- Alcohol 96º. El alcohol retira el colorante de las gram- debido a su diferente estructura de la pared celular (tamaño de los poros).

- Safranina. Colorante básico diferenciador. Tiñe a las bacterias gram

Muestra:

Microorganismo fresco y aislado , en medio TSA.

Técnica:

1 Nos aseguramos de estar cerca del mechero y tenerlo todo alrededor de este para garantizar un ambiente estéril.

2 previo flameado del asa ,retiramos un par de colonias de la placa de TSA y la extendemos en el porta .

3 Con la pipeta depositamos dos gotas de agua y homogenizamos con el asa de siembra , y dejamos secar.

4 una vez seca lo fijamos al calor (flameado tres veces aproximadamente).

5Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.

6 Enjuagar con agua.

7 Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.

8 Enjuagar con agua.

9 Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no)

10 Enjuagar con agua.

11 Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.

Resultado:

Al ver al microscopo , se puede apreciar que son gram – dado su tono rojizo .

Observaciones:

Ya sabemos que es una gram – por lo que procedemos a sembrarla en un medio levine , especifico para gram - ,para saber mas de este microorganismo .

Siembra en levine de gram -

Fundamento:

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras.

Materiales:

Bata.

Papel de filtro .

Guantes .

Portas .

Placas petri.

Autoclave.

Asa de siembra .

Mechero bunsen.

Reactivos

Agar levine :

Peptona 10g

Lactosa 10g

Fosfato dipotásico 2g

Eosina 0,40g

Azul de metileno 0,065g

Agar 15g

Muestra:

Microorganismo aislado y fresco gram - .

Técnica:

1 Flameamos el asa de siembra en el mechero bunsen.

2 Cogemos una colonia de la placa de la práctica anterior.

3 Por estrías la depositamos en la placa de Petri , en el medio de cultivo ( levine).

4. Girando la placa, volvemos a estriar, dos veces mas , hasta que llegamos a la firma.

5. Las ponemos boca abajo, y procedemos a incubar a 37ºC 24 h.

Resultado:

A las 24 h observamos un crecimiento masivo a lo largo de todas las estrias ,apreciando alguna colonia aislada al final de la estría , de un color verde brillante metalizado ,es claramente positiva y muy probablemente se trate de e coli , por ser de este verde tan característico, para asegurarnos realizaremos distintas pruebas bioquímicas.

Observaciones:

No imaginábamos que fuese a tener ese color tan vivo ,ha sido muy bonito .

Pruebas bioquímicas de gram – lactosa+

Objetivo:

Realizar las pruebas necesarias que estén dentro de las posibilidades del laboratorio , para poder reconocer este microorganismo , del que de momento solo sabemos que es lactosa + (por el crecimiento en el medio levine) y por supuesto gram -.

Indol

Fundamento :

Agua de peptona , que sirve para detectar el indol , si hay es que la bacteria esta utilizando el triptofano , esto podemos saberlo añadiendo el reactivo kovacs .

Materiales :

Bata

Papel de filtro

Guantes

Tubos

Pipetas

Asa de siembra

Rectivo :

Agua de peptona

Reactivo kovac

Muestra:

Microorganismo de placa levine g(gram- y lactosa +)

Técnica:

1En ambiente esteril , cerca del mechero se recoge una colonia aislada de la placa levine .

2 Se inocula en agua de peptona y lo incubamos 24 h a 37 ª

2 Se añade 5 gotas de reactivo Kovac, y se observa.

Resultado :

Nos dio negativo , pero puede ser por que no sembramos bien , ya que apenas se observava turbidez , y al reste le salio positivo .

Rojo de metilo

Fundamento :

El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar

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