Práctica No. 5 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS

Práctica No. 5

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS

Investigar los siguientes conceptos:

.‘Salting out’

. Precipitación diferencial

. Carga de las proteínas

. Punto Isoeléctrico

. Formación de sales

. Solventes orgánicos

El alumno debe tener claras las distintas formas que hay de precipitar a las proteínas y sus usos.

En esta sesión se practicarán las siguientes formas de precipitar a las proteínas:

. Precipitación por Salación o ‘salting out’.

. Precipitación por Solventes orgánicos.

. Precipitación por Formación de Sales.

. Reacción del Biuret.[pic 1]

Es responsabilidad del alumno el consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de las diversas formas de precipitar a las proteínas, así como los fundamentos de la reacción del Biuret. En la ‘Hoja de Datos’ deberá mencionar esos fundamentos.

MATERIAL NECESARIO:

Gradilla                                                                     Probeta de 50 o 100 ml.

10 tubos de ensaye de 13 x 100                           Embudo

Agitador                                                                    Pipeta de 5 ml

2 vasos de precipitados de 250 ml                         2 vasos de precipitados de 50 ml

9 tubos de ensaye de 13 x 100                                4 tubos de ensaye de 15 x 150

Escobetilla                                        jeringa ó perilla

Además: Cada grupo se responsabilizará de traer un huevo de gallina.

PROCEDIMIENTO

Precipitación por Salación (Salting Out)

1. Rompa un huevo y separe la yema de la clara. Descarte la yema y vacíe la clara en un vaso de precipitados de 250 ml.

2. Agite suavemente la clara. No agite vigorosamente pues provocaría la producción de espuma, cosa que no es recomendable. (Toda solución proteica si se agita produce espuma. Si la proteína es enzima se desnaturaliza).

3. Filtre a través de gasa. Puede filtrar directamente a una probeta para calcular la cantidad de filtrado que se obtuvo.

4. Mida el volumen de filtrado obtenido y vacíelo a otro vaso de precipitados de 250 ml. Añada un volumen igual de una solución saturada de Sulfato de Amonio (15 mL). Agite suavemente y transfiera la solución a tubos cónicos (proporcionados por el instructor).

5. Centrifugar a 2500 RPM por 5 minutos. El precipitado contiene la ovoglobulina y el sobrenadante contiene la ovoalbúmina todavía en solución.

6. Disuelva este precipitado en un vaso de precipitados de 100 ml añadiendo 15 ml de Cloruro de Sodio al 1 % .

7. Conserve estas soluciones para hacer la siguiente reacción. Lo que acaba de hacer es la:

Precipitación de la Ovoalbúmina y la Ovoglobulina por Salación

Reacción de Biuret

1. Coloque en su gradilla 3 tubos de ensaye de 13 x 100 e identifíquelos de alguna manera.

2. Pipetee 1.0 ml de agua destilada al tubo número 1.

3. Pipetee 1.0 ml de solución de ovoalbúmina al tubo número 2 y 1 ml de solución de ovoglobulina al tubo número 3. (Estas son las soluciones que obtuvo en la primera parte).

4. Agregue 1.0 ml del Reactivo de Biuret ya preparado a cada uno de los tres tubos. Agite bien y deje reposar por unos 10 minutos.

5. Observe el color desarrollado en los tubos dos y tres que deben ser positivos para la reacción.

6. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la:

Detección de Proteínas por la reacción de BIURET.

Precipitación por Solventes Orgánicos

1. Coloque en la gradilla cuatro tubos de ensaye de 15 x 150 e identifíquelos de alguna manera.

2. Pipetee 1.5 ml de Albúmina de huevo al 0.1 %, ya preparada, a los tubos uno, dos y tres.

3. Pipetee 2.0 ml de Agua Destilada al tubo número cuatro.

4. Pipetee 0.5 ml de Acido Clorhídrico 0.1 N al tubo uno.

5. Pipetee 0.5 ml de Hidróxido de Sodio 0.1 N al tubo dos.

6. Pipetee 0.5 ml de solución amortiguadora de Acetato pH 4.7 al tubo tres.

7. Pipetee 2.5 ml de Etanol al 95 % a cada uno de los cuatro tubos.

8. Observe la turbidez relativa de los tubos, que indica la precipitación.

9. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la

Precipitación de la Ovoalbúmina con solvente orgánico a distintos pHs.

Precipitación por Formación de Sales

1. Coloque seis tubos de ensaye de 13 x 100 en su gradilla e identifíquelos de alguna manera.

2. Pipetee 1.0 ml de Albúmina de huevo al 0.1 %, ya preparada, a los tubos uno, tres y cinco.

3. Pipetee 1.0 ml de Agua Destilada a los tubos dos, cuatro y seis.

4. Pipetee 0.25 ml de Cloruro de Mercurio al 5 % a los tubos uno y dos.

5. Pipetee 0.25 ml de Nitrato de Plata al 1 % a los tubos tres y cuatro.

6. Pipetee 0.25 ml de Acido Tricloroacético al 10 % a los tubos cinco y seis.

7. Observe la formación de precipitado en los distintos tubos.

8. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la:

Precipitación de Ovoalbúmina Por formación de SALES.

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

Precipitación por ‘Salting out’

Total en ml de filtrado obtenido: ________________

Cantidad de Sulfato de Amonio Sólido agregado al filtrado de la solución de Ovoalbúmina: ________________________

Reacción del Biuret

Precipitación por Solventes Orgánicos

Precipitación por Formación de Sales

FUNDAMENTO DE LAS REACCIONES

Escriba concretamente cual es el fundamento de cada uno de los procedimientos realizados. Si es necesario consulte el libro de texto.

• Precipitación por Salación (Salting out)
• Reacción del Biuret
• Precipitación por Solventes Orgánicos.

• Precipitación por Formación de Sales.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es, en general, la solubilidad de las proteínas globulares y a qué se debe esta solubilidad?

2. Conociendo lo que es el ‘Salting out’, ¿qué significará el procedimiento del ‘Salting in’?

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