Pureza del RNA

Discusión

• Pureza del RNA

La muestra trabajada fue la denominada Rompiente 1, la cual tuvo una pureza de 1.83 de la relación de la absorbancia a 260 nm contra la absorbancia de 280 nm ya que los ácidos nucleicos tienen una absorbancia máxima a 260 nm y las proteínas a 280 nm, lo cual indica que es una pureza aceptable o que la contaminación por proteínas es aceptable para las pruebas, la fórmula utilizada es dividir la absorbancia dada a 260 nm entre la absorbancia dada a 280 nm cuando se utiliza un espectrofotómetro convencional, aunque en este caso se utilizó un NANODROP que nos dio automáticamente esa relación. En comparación con otras pruebas como Verde 1 con 1.48, Verde 2 con 1.55, Rompiente 2 con 1.73, Rojo 1 con 1.46, y Rojo 2  con 1.49, que indica que estas muestras estaban contaminadas, algunas otras menos.

• Gel de integridad

En el gel de agarosa que se utilizó para probar la integridad del RNA se pudo observar que el RNA estaba degradado, ya que se observó que en todas las columnas no hubo bandas como se esperaba, sino que únicamente se encontró una línea difuminada hacia el extremo contrario de donde se sembraron las muestras, esto se vio en las 6 muestras. Esto se pudo deber a la presencia de RNasas que degradaron el RNA, ya sea por mal manejo de la muestra o que el equipo y/o material utilizado, estuviera comprometido y contuviera RNasas.

• Gel del PCR

En el gel de PCR se pudo ver en la muestra Rompiente 1, que fue sembrada un pozo después del marcador molecular ósea el pozo 2, se observó que el cDNA está degradado, y ocurrió algo parecido con el gel de integridad, quizás por contaminación con DNasas. En cambio otras muestras sembradas en pozos posteriores si se encontraron bandas, en el pozo 3, 4 y 6,  se encontró una banda no muy lejanas una de la otra pero en el 5 se encontró una banda más gruesa, estas bandas se encuentran en aproximadamente 100 pb y 200 pb según indica el marcador de peso molecular que cada banda representa un peso molecular de 100 en 100 empezando por 100 pb pero en el pozo 5 no se puede apreciar una banda o signos de degradación, esto se pudo deber a dos cosas, la primera a que como el PCR se realizó con una solo temperatura (55°), entonces el primer utilizado para esa muestra no hibridó y por consiguiente, la TaqPolimerasa no copio ese cDNA y la otra que no se sembró de manera correcta la muestra. En el pozo 6, se encontraron diferentes bandas con diferentes pesos moleculares, esto quiere decir que el primer que se utilizó para esa muestra no hibrida bien a la temperatura que se puso en el termociclador con el gen de nuestro interés, o bien si hibrida, pero también hibrida con otros genes de diferentes pesos moleculares, y al hibridar el primer con otros genes, la TaqPolimerasa amplifico también esos genes, eso causo que se mostraran varias bandas, para poder saber el peso aproximado de cada banda se necesitaría repetir la electroforesis, ya que el marcador molecular no se separó bien, pero esta vez se tendría que hacer un gel más concentrad para que retenga las mejor las bandas y se separen bien. Para calcular el peso exacto de cada banda se puede usar el tiempo de retención (Rf). En el caso en el que las bandas fueron muchas o no se encontraron bandas se puede aumentar la astringencia de la prueba al especificar la temperatura especial de cada primer y hacerlo por separado.

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