Revisión mecanismo CRISPR-Cas9 y su uso en el organismo modelo en plantas Arabidopsis thaliana

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REVISIÓN DEL MECANISMO CRIPR-CAS9

Uso en el organism modelo de plantas Arabidopsis thaliana

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Resumen

La edición genómica se ha estudiado y se estudia actualmente con el objetivo de modificar genéticamente determinados organismos. Esto resulta de gran utilidad tanto para ampliar el conocimiento científico como para progresar en determinados ámbitos, tales como la cura de enfermedades relacionadas con la genética o la generación de alimentos transgénicos con propiedades mejoradas. Las herramientas que hasta hace algunos años se planteaban para ello han sido reemplazadas en gran medida por la interferencia del CRISPR/Cas, que presenta múltiples ventajas respecto a las anteriores y se basa en el empleo de un RNA complementario a la secuencia a modificar que guía a la proteína encargada del metabolismo del DNA diana. El CRISPR/Cas se ha estudiado exhaustivamente y se han desarrollado diversas técnicas para su uso, desde la mutagénesis dirigida empleando nucleasas o nickasas hasta la regulación transcripcional y/o epigenética. Las principales probaturas que se han realizado han sido con organismos modelo, con prometedores resultados, en las cuales, además, se han encontrado las dificultades asociadas a su uso. La mayoría de los trabajos acometidos hoy en día en el ámbito de la edición genómica se centran en superar estos obstáculos. La principal causa de que actualmente los esfuerzos se focalicen en subsanar los problemas inherentes al empleo del CRISPR/Cas es la posibilidad de obtener una herramienta sencilla de diseñar y utilizar, económica y, sobre todo, versátil, con la cual se pueda realizar un paso de escala hacia cualquier otro organismo, como humanos o árboles. El éxito de este paso de escala supondría un enorme progreso científico, al poder modificar genéticamente cualquier organismo a voluntad, aprovechando esto para llevar a cabo incontables avances en campos como la medicina, la ganadería o la agricultura.

Abstract

Genome editing has been and is studied nowadays in order to genetically modify determined organisms. That is particularly useful to amplify the scientific knowledge and to advance in some fields, such as the treatment of genetic diseases or the generation of transgenic crops with improved properties. The tools which were used until a few years ago have been replaced by the irruption of the CRISPR/Cas, that presents numerous advantages when compared with the previous tools and consists on a RNA, complementary with the target sequence, that guides the protein whose function is the metabolism of the target DNA. The CRISPR/Cas has been studied in depth and different techniques have been developed about his utilisation, from directed mutagenesis with nickases or nucleases to transcriptional and/or epigenetic regulation. The main assays have been carried out with model organisms, with promising results, and have shown the CRISPR/Cas-associated problems. Most of the experiments today about the genomic editing are focused on overcome these difficulties. The main cause of that is the possibility to obtain a tool which is very simple to design and use, inexpensive and, above all, with versatility, that is, capable to be used in whatever organisms, for instead, humans or trees. The succesfull in this step may achieve an enormous scientific progress, because we would be able to modify any organisms as we want, taking advantage of that for undertaking uncountable improvements in branches as medicin, livestock farming or agriculture.

Índice

Resumen        2

Abstract        2

Introducción        4

Técnicas de edición del genoma        4

Tecnología CRISPR/Cas        6

Mecanismos CRISPR/Cas        6

Objetivo        8

Metodología y plan de trabajo        8

Historia        8

Clasificación        10

Clase 1        10

Tipo I        10

Tipo III        11

Tipo IV        11

Clase 2        12

Tipo II        12

Tipo V        12

Tipo VI        13

Usos del CRISPR-Cas y aplicaciones en Arabidopsis thaliana        13

CRISPR/Cas9 con nucleasas        14

Cas9 mutada a nickasa        17

CRISPR/dCas9 como regulador transcripcional        19

Paso de escala        23

Conclusiones        24

Referencias        24

Introducción

La realización de modificaciones en el genoma de un organismo de forma dirigida es un procedimiento eficaz para el estudio de los efectos que pueden tener diversas mutaciones en el mismo. Estas modificaciones genómicas tienen como principal objetivo conocer los efectos fenotípicos que pueden producir diversas alteraciones genotípicas24. Esto presenta un enorme potencial para aplicaciones científicas como la medicina o la biotecnología63. Para ello, se han desarrollado diversas aplicaciones, con el objetivo de emplear técnicas de ingeniería genética dirigida para modificar como se desee el genoma de un organismo2.

Técnicas de edición del genoma

Una posible metodología para llevar a cabo la edición genómica sería el uso de RNA interferente (RNAi) para realizar el knockdown deseado. Sin embargo, este procedimiento no permite una inhibición permanente, además de que presenta poca reproducibilidad entre experimentos17.

Una alternativa interesante que se ha abierto camino en la última década es el uso de nucleasas quiméricas, sintetizadas mediante dominios de unión a DNA específicos fusionados con dominios de corte no específicos17, que permiten introducir la mutación deseada a nivel genético, es decir, generando un cambio permanente y heredable en el organismo63, incluidas inserciones, deleciones y sustituciones70. Estas nucleasas pueden inducir rupturas de doble cadena en los lugares indicados para introducir mutaciones específicas y, de esta manera, producir la alteración deseada. Tradicionalmente, se han utilizado para tal fin las nucleasas de dedos de zinc, ZFN (Zinc-Finger Nucleases)44,70. Este fue el primer método desarrollado para la generación de endonucleasas “personalizadas” y consisten en enzimas quiméricos, compuestos por un dominio de “dedo de zinc” (ZF), el cual se une al DNA, y un dominio de escisión bacteriano de la endonucleasa FokI (Figura 1). Un dominio ZF individual consta de unos 30 aminoácidos y cumple con la típica estructura eucariota de unión a DNA Cys2-His2 en dominios ββα muy conservados. Su síntesis se plantea por pares, de forma que los dominios ZF se unan a las secuencias que flanquean la región diana (de 9-18 pb) y, posteriormente, la endonucleasa fusionada con estos dominios produzca su rotura de doble cadena al unirse a la región que separa este dímero de dominios ZF (de unos 5-7 pb)17, para luego introducir la mutación que se quiere generar75. No obstante, los sistemas ZFN presentan notorias desventajas, como la dificultad en la síntesis de los enzimas quiméricos44, así como su elevado coste económico o la dificultad de los dominios ZF para reconocer secuencias pobres en guanina75, lo cual hace perder afinidad por el DNA y, por tanto, eficacia en el proceso24,34.

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