Revision Bibliográfica Cnidarios

Información general y técnicas biotecnológicas de la clase Antozoa del filo Cnidaria

VILLARROEL ESTÉVEZ NATALIA Y.

UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

Resumen:

Las sustancias toxicas que se obtienen de los antozoos son muchas y su aplicación es muy grande, ya que se pueden utilizar para la elaboración de nuevos fármacos capases de curar varias enfermedades.

Las anemonas marinas poseen nematocistos que contienen sustancias que sirven para la defensa contra depredadores o captura de presas (Quiroz, 2005) , las sustancias que secretan los nematocistos son muy toxicas para el hombre causando incluso su muerte.

Entre los polipéptidos que componen este veneno se encuentran inhibidores de proteasas, un bloqueador de canales K+, una fosfolipasa y 2 citolisinas: Sticholysina I (St I) y Sticholysina II (St II) (Díaz Concepción Alina, 1999).

Introducción:

Las Antozoos son una clase de los cnidarios también son conocidos como “animales flor” se diferencian de las otras clases de cnidarios por no presentar fase de medusa, es decir solo se los encuentra de forma sésil, habitan tanto aguas profundas como superficiales, varían mucho en tamaño, pueden formar colonias o ser solitarias, poseen esqueleto en su mayoría (Cleveland P., 2000).

Las anemonas marinas presentan nematocistos estructuras toxicas, por medio de anemonas marinas se han obtenido un gran número de péptidos con capacidad de unirse con especificidad a canales iónicos. En Cuba estudios realizados para la optencion de toxinas de anemonas marinas va desde los años 80. Las especies más estudiadas han sido Stchodactyla helianthus, Bunodosoma granulifera, Condytactis gigantea, Phyllactis flosculifea y Epicystis crucifer. Por medio de estas se han aislado nuevos compuestos tales como moléculas formadoras de poros, toxinas bloqueadoras de canales de K+ , fosfolipasas, toxinas con efecto sobre Na+, neurotoxinas inhibidoras de proteasas (Anoland G. Garateix Fleites, 2010).

Stichodactyla helianthus es una anemona presente en el Mar Caribe de la cual se han purificado y caracterizados dos citolisinas: Sticholisina I (St I) y Sticholisina II (St II), son proteinas muy estudiadas en el Laboratorio de Biomembranas del Centro de Estudios de Proteínas (C.E.P.), St I y St II son toxinas isomorfas similares a las presentes en actinoporinas, caracterizándose por tener altos puntos isoeléctricos (Rodríguez Rodríguez, 2010).

Las sticholisinas son grandes activadores hemolíticos, tambien presentan un mecanismo de lisis que transita por la formación de un poro en la membrana con un radio funcional del orden de 1 nM (Rodríguez Rodríguez, 2010). Se caracterizan peso molecular de 20kDa, ausencia de Cys, estructura organizada en hoja plegada beta y alto pl (Escalona Rodríguez, 2010).

La gran actividad citotóxica de las sticholisinas han sido utilizadas en obtener inmunoconjugados contra parásitos unicelulares y contra células de la línea tumoral de colon SW948, sin embargo la elevada toxicidad de las sticholisinas impone un obstáculo a superar en cualquier aplicación biomédica que se persiga con estas proteínas. Una alternativa para reducir la actividad inespecífica de las sticholisinas es la obtención de mutantes en posiciones claves para su función, de manera que se pueda modular su actividad lítica (Rodríguez Rodríguez, 2010).

Técnicas Biotecnológicas:

Dadas las potenciales aplicaciones de las mutantes de Sts, obtuvieron en el laboratorio de Biomembranas del CEP, la StI F15C, una mutante de St Ir, donde se realizó la sustitución por cys de la fenilalanina 15 correspondiente a la región N-terminal. Para la purificación de la St I F15C se realizó una cromatografía de intercambio ionico utilizando una columna de 1,5x15 cm con un matraz de intercambio catiónico carboximetil-celulos, equilibrada con fosfato de sodio 0.02 M pH 7. Para la purificación de St I F15C y el análisis de su pureza se analizaron fracciones diferentes por SDS-PAGE (Rodríguez Rodríguez, 2010) .

Para la determinación de la actividad hemolítica frente a los eritrocitos humanos de St I F15C purificada se utilizó un espectrofotómetro con celdas termostatadas a 25°C y un controlador de temperatura. El ensayo se realizó en 1 mL del estándar eritrocitario usando cubetas plásticas de 1 cm de paso de luz. Como patrón se empleó una solución de St Ir de concentración conocida (Rodríguez Rodríguez, 2010).

Para la determinación de la actividad hemolítica de StI y StII se preparó una suspensión de eritrocitos frescos humanos lavados y resuspendidos, la concentración del estándar de células fue ajustada por adición del tampón para obtener una concentración de células. Para determinar la actividad hemolítica se adicionó St I y St II a de la solución del estándar de eritrocitos (Díaz Concepción Alina, 1999).

La acvidad hemolíca se determinó mediante la disminución del valor de absorbancia de la luz dispersada, el ensayo se realizó en un lector Multiscan EX, la solución eritrocitaria fue preparada mediante una muestra obtenida por un donante sano (Hervis Valdés, 2014).

Para el estudio del efecto de algunos agentes farmacológicos en la agregación plaquetaria inducida por StI y StII incubaron el PRP durante 1 min con una de sustancias: ácido etilendiaminoitetracélico (EDTA), ácido acetilsalicítico (ASA), prostaciclina (PGI2), teofilina y verapamilo previo a la adición de las citolisinas, las cuales se ensayaron a las concentraciones de 1 y 5  g/mL (Díaz Concepción Alina, 1999).

Para obtener las mutaciones St I P80C se produjo mediante tres reacciones en cadenas polimeras (PCR), en la primera y segunda reacción fue utilizado el modelo de vector Pet3a-stir y las paredes de oligonucleótidos promotor, en la tercera reacción se utilizó como molde los productos de PCR purificados de las primeras reacciones (Hervis Valdés, 2014).

Según Escalona Rodríguez (2010), para marcaje sitio específico con sondas de radicales de spín paramagnético de tipo maleimido-nitroxido de mutantes de cisteína de sticholisina I (St I), una proteína formadora de poros de la anémona Stichodactyla helianthus fue necesaria la presencia de una única Cys en los mutantes de StI permite la unión sitio específica de las sondas de spin del tipo maleimido–nitroxido. El grupo maleimido reacciona específicamente con el grupo sulfihidrilo (-SH) de las Cys, mientras que el grupo nitroxido es el que contiene el electrón libreque será monitoreado por espectroscopia de resonancia paramagnética.

Un total de 176 ejemplares de Anthothoe chilencia se transportaron vivos al laboratorio de mar, los tentáculos fueron procesados conjuntamente con los cuerpos, el método utilizado

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