TALLER DE BIOLOGÍA. HELICASAS

TALLER DE BIOLOGÍA

1. Demostrar experimentalmente la función de todas las proteínas que conforman el complejo de replicación.

Un tubo de ensayo con todas las proteínas que conforman el complejo, con el ADN, con toda la maquinaria para la replicación. Este nos servirá de control.

Sabemos la función de cada una de las proteínas.

• HELICASAS:

Las helicasas separan las hebras de ADN para iniciar la replicación.

*En un tubo de ensayo tenemos una molécula de ADN ya secuenciada, también una de las cadenas de ADN complementaria y también las helicasas.

*Esta cadena complementaria está marcada radioactivamente para diferenciarla de la molécula de ADN.

*Evitamos insertar en el tubo de ensayo las proteínas de unión a ADN de cadena sencilla (SSB/RPA); para evitar que se inhiba la unión que queremos causar.

*La cadena complementaria, se uniría a los nucleótidos que, ya separados por la Helicasa, quedan dispuestos para que los puentes de hidrogeno hagan su trabajo.

*Podríamos tener un control, donde la excepción en el experimento sea la Helicasa.

*La electroforesis de ambas demostrará la diferencia de pesos por la unión de la cadena complementaria. Y cuando lo revelemos en una placa de rayos x, veremos a la cadena radioactiva.

• TOPOISOMERASAS

La función de estas proteínas es evitar los superenrollamientos del ADN.

*Similar al ejercicio anterior, tenemos dos tubos de ensayo. Uno con toda la maquinaria de replicación; el otro con toda la maquinaria a excepción de las topoisomerasas.

*Los superenrollamientos, cuando las tensiones son muy altas, causan rompimiento del ADN. Así que suponemos que en el tubo #2 ese sería el resultado.

*Es también conocido el efecto de algunos medicamentos quimioterápicos de inhibir las topoisomerasas para acelerar la apoptosis. Este podría ser otro acercamiento para evidenciar la importancia de esta proteína y su función vital para la salud.

• PROTEÍNAS SSB

Mantienen separadas las dos cadenas complementarias del ADN separadas por la helicasa.

        DEL PRIMER EXPERIMENTO

        *Dos tubos de ensayo, uno con las proteínas otro sin las proteínas.

        *En cada tubo de ensayo una hebra complementaria.

        *Sin las proteínas SSB la hebra complementaria no tendrá ningún bloqueo para unirse.

*Cuando hay presencia de SSB vemos que las hebras se mantienen separadas, y que la unión a otra hebra es bloqueada momentáneamente. Si hay presencia de ADN Polimerasas aquí, la cadena “extra” quedará ahí y una electroforesis demostrará este resultado, ya que mostrará dos desplazamientos.

• ADN POLIMERASAS

ADN Polimerasa III: Sin duda una de las proteínas más importantes en este proceso.

*Considero que es simple. Damos todas las condiciones de replicación a excepción del ADN Polimerasa III. Al comparar este resultado con el control, veremos la formación de las dos cadenas en el segundo y el proceso interrumpido en el primero.

ADN Ligasa: Secuenciar el ADN y notar la ausencia de conexiones entre fragmentos de Okazaki.

ADN Polimerasa I: Marcar las ubiquitinas para que veamos que no han sido corregidas.

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