TECNICA ANALITICA PARA LA DETERMINACION DE PROTEINAS

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TECNICA ANALITICA PARA LA DETERMINACION DETERMINACION DE PROTEINAS

SEGUN LOWRY

1.        PRINCIPIO DEL METODO

La cuantificación de la concentración de proteínas en la biomasa se realiza con el método colorimétrico de Lowry (Lowry et al., 1951) modificado por Peterson (1977). El principio del método se basa en que ciertos amonio ácidos como tirosina, triptófano y cisteína reaccionan en un medio-alcalino con ácido fosfotungsténico y ácido molíbdico del reactivo de Folin (color amarillo) para dar un complejo incoloro que se puede reducir mediante una reacción lenta con fenol en un complejo de coloración azul detectable por espectrofotometría entre 600 y 900 nm (con una absorbancia máxima a 740 nm).

Esta coloración se refuerza por el acomplejamiento de sulfato de cobre con los enlaces peptídicos de las proteínas. La intensidad de la coloración obtenida depende del número y de la naturaleza de los residuos que constituyen la proteína presente en la muestra a analizar ya que a iguales concentraciones dos proteínas diferentes no desarrollan la misma intensidad de color. (Figura 1)

Figura 1. Esquema del proceso de obtención proteínas

El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la Ley de Lambert-Beer.

Este método consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la         segunda etapa de la reacción.

        El Cu2+, se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador.

El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

2.        REACTIVOS

1. Reactivo A: Na2CO3 al 2% en NaOH 0,1 M (pesar 2 g de carbonato y adicionar 0,4 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 mL con agua destilada)
2. Reactivo B1: CuSO4 × 5H2O al 1% (1 g en 100 mL de agua destilada).
3. Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2% (2 g en 100 mL de agua destilada).
4. Reactivo C (Reactivo de Lowry): Se prepara, mezclando los reactivos: A, B1 y B2, en proporciones 50 : 0,5 : 0,5 (en volumen).
5. Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1:4 en agua, 10 ml de reactivo comercial y 40 ml de agua destilada.
6. Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA) (1 mg/mL)
7. Muestra problema

3.        APARATOS Y EQUIPOS

1. Tubos de vidrio
2. Pipetas automáticas
3. Agitador de tubos
4. Baño maría
5. Cubetas de vidrio
6. Espectrofotómetro

4.        PROCEDIMIENTO

4.1        Tratamiento de la muestra

1. Extracción de proteínas: tomar 5 mL de la muestra de suspensión celular y adicionar 5 mL de NaOH 1 N, agitar y llevar a baño María a 100°C por 5 minutos. Luego tomar 1 mL y realizar el análisis. El factor de dilución (FD) corresponde a 2, por lo tanto el resultado se multiplica por 2.

• Tomar 1 mL de muestra y añadirlo en un tubo.
• Añadir 5 mL del reactivo de Lowry y agitar vigorosamente durante 30 segundos en el agitador.
• Esperar 10 minutos.
• Añadir 0,5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteau de fenol mientras se agita la muestra.
• Proteger las muestras de la luz durante 30 minutos.
• Medir la absorbancia a 740 nm empleando como blanco una muestra con agua destilada a la que se aplicó el mismo procedimiento que a las muestras.

1. Para la determinación de proteínas se construye una curva de calibración:

La recta de calibrado se determina usando un patrón de albúmina bovina con una concentración de 1000 mg/L que se diluye para obtener concentraciones en el intervalo 50 - 400 mg/L. Se aplica una regresión lineal donde se representa la función exponencial de los valores de absorbancia obtenidos frente a la concentración de proteína en mg/L.

El tubo 0, que sólo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del espectrofotómetro a cero de absorbancia. Se obtiene una regresión exponencial como la siguiente:

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