Tincion Azul de comassie

TINCIÓN CON AZUL DE COOMASSIE

FUNDAMENTO.

Para estudiar  las proteínas presentes en algunos órganos, tejidos y/o células en cultivo puede realizarse una tinción con azul de Coomassie, un colorante que presenta  afinidad contra todo tipo de proteínas de interés en la célula. En el caso de los cultivos celulares se une a todas las proteínas de las células pero es de notarse que resaltan por su citoarquitectura aquellas del citoesqueleto por ejemplo permiten la detección de los filamentos

PROTOCOLO

1. Se hace la siembra de células en cubreobjetos y se permite su propagación.
2. Se elimina el medio y se fijan con paraformaldehído al 4% o formalina acuosa al 10% en buffer salino de fosfatos (PBS: NaH2 PO4 1.9 mM, Na2HPO4 8.1 mM, NaCl 154 mM, pH 7.2), se incuban por 20 minutos y se lavan con PBS.

[pic 1]Figura 1. Eliminación del medio

1. Se permeabilizan las células con tritón X100 0.5% en PBS por 5 minutos y se lavan con PBS. Figura 1. Aplicación del tritón[pic 2]

1. Se adicionan 30 - 50 μl de azul de Coomassie (para teñir las proteínas) en cada cubreobjetos y se dejan incubar por 20 min en cámara húmeda.

[pic 3]Figura 3. Azul de Coomassie sobre las células

1. Se lavan con PBS y finalmente se hace un lavado con agua desionizada.

[pic 4] Figura 4. Lavado

1. Se hace el montaje de los cubreobjetos sobre portaobjetos.

[pic 5]Figura 5. Montaje

7. Se observan las células en microscopio óptico.

[pic 6]Figura 6. Observación en le microscopio.

FLOURECENCIA INDIRECTA

1. Se hace la siembra de células en cubreobjetos y se permite su propagación.

 2. Se elimina el medio y se fijan con paraformaldehído al 4% en PBS o formalina acuosa al 10% en PBS, se incuban por 20 minutos y se lavan con PBS.

[pic 7]Figura 1. Lavado posterior al paraformaldehído

 3. Se permeabilizan las células con tritón X100 0.5% en PBS por 5 minutos y se lavan con PBS.

 4. Se bloquean con albúmina sérica bovina 1% en PBS por 20 min y se lavan con PBS.

[pic 8]Figura Bloqueo con albumina

5. Se adicionan 30 - 50 μl de faloidina conjugada con rodamina diluida 1:150 en PBS (para marcar actina) en cada cubreobjetos y se dejan incubar por 20 min en cámara húmeda en obscuridad.

[pic 9]Figura 3. Aplicación de Faloidina

1. Se lavan con PBS y finalmente un lavado con agua desionizada

[pic 10]Figura 4. Lavado con agua desionizada

1. Se hace el montaje de los cubreobjetos sobre portaobjetos.

[pic 11] Figura 5. Montaje en el portaobjetos

1. Se observan las células en microscopio de fluorescencia.

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