Transformación De Levaduras

Transformación de Levaduras

Material:

Cepa a transformar

Plásmido (cuantificado)

Medio YPD liquido

Cajas de medio SC sin la auxotrofía

Matraz de 50 mL estéril

Espectrofotómetro

Centrifuga.

Agua estéril

Acetato de Litio 1 M

PEG(PoliEtilenGlicol) PM 3350 al 50%

ADN de esperma de salmon (2 mg/mL o 10 mg/mL)

Buffer TE (Tris-EDTA)

DMSO(DiMetil SulfOxido)

Colocar en incubación a 30º C por 24 horas, un precultivo de la cepa a transformar en YPD.

Al día siguiente inocular 2 mL del cultivo en 30 mL de medio YPD. Incubar a 30° C con agitación, hasta que la D.O. (600 nm) alcance entre 0.6-0.8

Centrifugar en tubos Eppendorf 10 mL del cultivo a 3000 rpm por 5 minutos.

Resuspender todos los botones de los tubos en 1 mL de agua estéril y lavar.

Resuspender en 1 mL de agua estéril.

Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos.

Resuspender en 300 μL de Acetato de Litio 100 mM (Fresco diluido con agua de un stock 1 M) (300 μL para 6 a 8 reacciones de transformación)

Poner 50 μL en cada tubo Eppendorf (1 tubo por cada ADN + 1 control sin ADN)

Añadir mezcla transformante a cada tubo (en orden exacto):

-240 μL de PEG 3350 al 50%

-36 μL de Acetato de Litio 1 M

-25 μL de ssADN 2 mg/mL (pre-hervido por 5 minutos, colocar de inmediato en hielo)

-50 μL de plásmido de ADN (diluir el ADN superenrollado en TE(Tris-EDTA), usar aproximadamente 500 ng por transformación y llevarlo a un volumen de 50 μL)

Mezclar en vortex.

Incubar con agitación a 30° C por 45 minutos.

Añadir 43 μL de DMSO a cada tubo (incrementa la eficiencia de la transformación)

Dar a los tubos un Heat-shock a 42° C por 15 minutos, pasar a hielo

Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos para separar el PEG, decantar.

Añadir 600 μL de agua estéril, resuspenda con una punta de pipeta.

Platear con asa de vidrio 200 μL por caja. Para selección de auxotrofía, usar cajas de CAA sin la auxotrofía correspondiente.

Incubar a 30 ° C por 48 horas.

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