Trasnformacion ingenieria genetica

TRANSFORMACION DE CELULAS COMPETENTES DE ESCHERICHIA COLI.

Carrascal Antony1, Navarro Laureano1, Velásquez Maria1 & Viloria Gina1.

1. Universidad de Sucre, Facultad de Educación y Ciencias, Programa de Biología, Línea de profundización en Biotecnología, Informe de Ingeniería Genética, Sincelejo-Colombia.

RESUMEN

La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membranas celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. Es así, que al trabajar con la cepa MM294 de Escherichia Coli, implicando procedimientos tales como crecimiento de la E.coli, preparación de células competentes y la transformación de estas, se observaron resultados, donde hubo crecimiento con un número significante de colonias.

PALABRAS CLAVE: Plásmido, Escherichia coli, transformación, DNA genómico.

INTRODUCCION

La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula.1

En el laboratorio se ha conseguido poner a punto técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos químicos o físicos que producen microporos en la célula, lo que permite la introducción del DNA exógeno (transformación) de modo bastante eficiente. Uno de los métodos físicos es la electroporación, consistente en inducir la competencia mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy breve e intenso. Dicha competencia se puede inducir con tratamientos químicos utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las células del cultivo se hacen competentes.2

La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El método que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno de los más utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformación, el DNA introducido llevará un marcador seleccionable en el medio adecuado.3

[pic 1]

Uno de los métodos físicos es la electroporación, el cual es un método físico para transformaciones bacterianas, este presenta una eficiencia de entre 109 y 1010 de colonias transformantes por cada microgramo de ADN plasmídico empleado. En este procedimiento, una mezcla de ADN y las células receptoras es sometida a una diferencia de potencial muy alta (2500 v) por un periodo de tiempo muy corto (milisegundos). Dicha competencia se puede inducir utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Cabe resaltar que tras estos tratamientos no todas las células del cultivo se hacen competentes.4 El objetivo de la práctica fue transformar células competentes de E. coli utilizando plásmido pAMP e identificar los clones de E. coli transformados a partir de los marcadores de selección (resistencia a la ampicilina).

Metodología

Se trabajo gran parte del procedimiento en la cámara de flujo laminar.

[pic 2]

Figura1. Cámara de flujo laminar.

[pic 3]

Fig2. Plásmidos resistentes ampicilina

Crecimiento de Escherichia coli

[pic 4][pic 5]

Fig. 3. Muestra de colonias de bacterias.                      Fig. 4. Cultivo LB inoculado con E.Coli.

1. La tarde anterior se los técnicos de laboratorio tomaron una muestra de una colonia de bacterias (fig.3) de una placa de Petri reciente, se transfirió 2 ml del medio LB. Se incubo en baño de maría a 37ºC, con una fuerte agitación durante toda la noche.
2. Inoculamos 1000 µl del medio LB, luego tomamos 500 µl del cultivo inoculado con E. coli (fig.4) lo depositamos en un tubo de eppendorf.

[pic 6][pic 7]

                         Fig. 5. Ajustando la temperatura   Fig. 6. Muestras sumergidas en baño de maría a 39 ºC.

                         en el baño de maría.

1. La muestra se sumergió en un baño de María a 39ºC (fig.6), realizamos una constante agitación, revisamos cada 5 min la temperatura a la cual estuvo expuesta la muestra, durante 30 min.

Preparación de células competentes

                      [pic 8][pic 9]

  Fig. 7. Muestras sacadas del baño de maría.        Fig. 8. Muestra incubada

1. La muestra se enfrió por 8 min en el hielo (fig.8).

[pic 10][pic 11]

                 Fig. 9. Muestras sometidas a centrifugación     Fig. 10. Resultados de la centrifugación.

                 3000rp por 10 min a 4ºC.

1. Realizamos una centrifugación a 3000 rp durante 10 min a 4 ºC (fig.9), luego descartamos el sobrenadante (fig.11).

El tubo de eppendorf se invirtió sobre un papel absorbente durante 1 min.

[pic 12][pic 13]

                       Fig. 11. Descarte del sobrenadante en           Fig. 12. Muestra con CaCl2.

                            hipoclorito al 13 %.

...