Fundamento

Fundamento

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

Existen medios cuya composición permite el crecimiento de:

1. un gran número de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud),

2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los denominados medios selectivos.

3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:

1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)

2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.

Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios sólidos, semisólidos y líquidos. Este último aspecto es importante a la hora de la preparación de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintéticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composición, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.

Objetivos concretos de la práctica

1. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro.

2. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiología.

3. Hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos. Adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para realizarlo.

Realización práctica

preparación de medios de cultivo

Cada mesa de trabajo se encargará de la preparación de una cantidad suficiente de un determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo de prácticas. Las instrucciones a seguir dependerán del número de mesa y el medio de cultivo asignado, pero en todos los casos, los pasos son los siguientes:

1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, añadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios líquidos no es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la completa disolución de la misma.

2. Esterilizar la disolución.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento será diferente:

a) Medios sólidos en placa.- Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar alautoclave (1210C) durante 15-20 minutos. Una vez estéril repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que solidifique.

b) Medios líquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razón de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapón de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.

Los medios de cultivo en microbiología

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

...