Patrón de buho

Abstracto

Antecedentes: Cuando se recogen muestras en el campo y transportados al laboratorio, la degradación de los ácidos nucleicos

contenida en las muestras se observa con frecuencia. Extracción inmediata y la precipitación de los ácidos nucleicos

reduce al mínimo la degradación, preservando así información de la secuencia exacta. Un método de extracción de

obtener ADN de alta calidad en los estudios de campo se describe.

Hallazgos: ADN extraído inmediatamente después del muestreo se comparó con el ADN extraído después de permitir el muestreo

los tejidos se sequen al aire a 21 ° C durante 48 ó 72 horas. Mientras que el ADN extraído de tejidos frescos exhibió poca degradación,

ADN extraído de todos los tejidos expuestos a 21 ° C de aire para 48 o 72 horas exhibieron diversos grados de degradación.

El rendimiento fue mayor para las extracciones de tejidos frescos en la mayoría de los casos. Cuatro microcentrífugas se compararon para el ADN

rendimiento: un estándar de microcentrífuga de laboratorio eléctrica (máx fcr = 16000 × g), dos de microcentrífuga a pilas

(max RCF = 5.000 y 3.000 × g), y uno de microcentrífuga de accionamiento manual (RCF max = 120 × g). Los rendimientos para todos

centrifugadoras fueron similares. ADN extraído en condiciones de campo simuladas fue similar en rendimiento y calidad de ADN

extraído en el laboratorio usando el mismo equipo.

Conclusiones: Este (bromuro de cetiltrimetilamonio) método de extracción de ADN CTAB emplea pilas y

equipos manualmente operada para aislar el ADN de alta calidad en el campo. El método fue probado en plantas y hongos

tejidos, y pueden adaptarse para otros tipos de organismos. El método produce ADN de alta calidad en el laboratorio

pruebas y en condiciones de campo simuladas. El método de extracción de campo debe ser útil para el trabajo en remoto

sitios, donde el hielo, hielo seco y nitrógeno líquido no están disponibles; donde es probable que se produzca la degradación debido a la larga

distancias entre el lugar de la muestra y el laboratorio; y en los casos en otra preservación de ADN y

métodos de transporte no han tenido éxito. Puede ser posible adaptar este método para genómico,

metagenómica, proyectos transcriptómica y metabolómica utilizando muestras recogidas in situ.

Palabras clave: la extracción de ADN, microcentrífuga pilas, centrífuga de accionamiento manual-

Fondo

Casi todos los métodos para extraer los ácidos nucleicos deben ser realizados

por ejemplo, en un laboratorio, [1-8]. Muchos sistemática,

estudios filogenéticos, moleculares y afines de plantas

y los hongos utilizan ADN y / o ARN como fuente primaria

de los datos [9.14]. En la mayoría de casos, se utilizan tejidos frescos

para la extracción de los ácidos nucleicos, porque la degradación

y otros procesos bioquímicos comienzan inmediatamente después

el tejido ha sido eliminado del organismo o de

su sustrato natural. Esto limita los estudios para las plantas y

hongos que se encuentran en proximidad a un laboratorio de investigación, incluyendo

los que se puede cultivar en invernaderos y / o

cámaras de crecimiento. Sin embargo, un gran número de investigaciones

Los estudios se llevan a cabo sobre los organismos que deben ser recogidos

en el campo.

Tres métodos han sido desarrollados para preservar ADN en

muestras de plantas recolectadas en el campo [15-18]. Uno emplea

gel de sílice como desecante para secar rápidamente el tejido, lo cual

reduce la degradación en la mayoría de los especímenes [15,18]. Sin embargo,

no elimina la degradación, y los rendimientos de ADN son bajos para

algunos tejidos [19]. El segundo método utiliza una  solución saturada

de NaCl-CTAB (es decir, bromuro de cetiltrimetilamonio salmuera-)

[18]. El alto contenido de sal deshidrata parcialmente los tejidos

y el complejo puede CTAB con ácidos nucleicos, proteínas

e hidratos de carbono para frenar los procesos de degradación. Sin embargo,

altos grados de degradación se han observado en algunos

casos con este método, y de vez en bajos rendimientos de ADN resultado [19]. La adición de ascorbato mitiga algunos de los

degradación. El tercer método utiliza un papel absorbente para

preservar el ADN [16]. Pedazos de planta o tejido de hongos

se estrelló en el papel, y luego se deja secar. Luego,

discos de papel se pueden usar (y reutilizar) para PCR

(reacción en cadena de la polimerasa) de amplificación. Si bien esto es

probablemente adecuada para muchos propósitos, la degradación tiene

ha informado [16]. Por lo tanto, otros medios de conservación

y puede ser necesario / o extracción. La extracción de ADN en el

El sitio de muestreo (es decir, in situ) es una alternativa posible que

puede reducir al mínimo la degradación y maximizar el rendimiento.

La degradación puede ser monitoreado por electroforesis en gel

porque como el ADN se descompone la mayor molecular

bandas de peso se convierten en fragmentos más difusos y más pequeños

de ADN se consideran cada vez más brillantes manchas de fluorescencia

que se extiende en las regiones de menor peso molecular de

El gel ver, por ejemplo, [8]. Sin embargo, esto sólo indica que

se produce la escisión de las cadenas de ADN. Al mismo tiempo,

otros procesos de degradación también se están produciendo, lo que resulta

en pérdidas de información de la secuencia [20,21]. Los más comunes

cambios son pérdidas de bases por ataque hidrolítico de

los enlaces glucosídicos. Despurinación ocurre con mayor frecuencia, pero

depyrimidization también se produce a un ritmo menor. Cuando estos

Los ADN se utilizan como plantillas para la PCR, aproximadamente el 75%

de las veces, una base inexacta se incorporará en

estos sitios, causando una pérdida potencial en la precisión de secuencia.

Desaminación de m5C (5-metilcitosina, frecuente en

rRNA gen loci) produce una timidina, que se asociará

con una adenosina en lugar de una guanosina durante la PCR

amplificación y secuenciación reacciones. La desaminación de

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