Tinción de Gram

Tinción de Gram

INTRODUCCIÓN

De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado conetanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) elcolorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Objetivos

• Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos

• Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia del objetivo de inmersión)

• Conocer y manejar las unidades de medida de las células y establecer comparaciones entre tamaños de procariotas y de eucariotas

• Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

Materiales

Mechero Bunsen o de Alcohol

Asa de Siembra o aguja enmangada

Pinzas

Portaobjetos

Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro Dental, Suelo, etc.

Palillos

Microscopios

Aceite de inmersión

Soporte de Tinciones

Goteros

Pinzas

Agua destilada

Colorantes para Tinción: Solución de cristal Violeta Lugol Safranina Etanol 95%

Procedimiento

I. prepara las muestras siguiendo estos pasos:

1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una pequeña cantidad de yogur con ayuda de un palillo higiénico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental extraído de la boca de alguien.2. Prepara una fina extensión (frotis), en otros portas, dejándolos secar.3. Fija este frotis dándole varios pases a los portas sobre la llama del mechero, con la muestra hacia arriba.

II Tiñe ahora los frotis fijados mediante los siguientes pasos:

1. Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se retirará el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para non desprender la muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y después se realizará otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta.2. Se retirará el colorante con etanol, goteándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las células Gram- pierden el colorante violeta y quedarán incoloras. Las Gram + seguirían violeta.3. Añade una gota de agua a la preparación y cubre las preparaciones 2 min. con safranina (colorante de contraste).Finalmente, lava el colorante con agua. Este colorante sólo entrará en las bacterias Gram –, que quedarán rojas. Las Gram + seguirán violetas.

Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsérvalas con microscopio utilizando el objetivo de inmersión. En esta tinción diferencial las bacterias Gram – aparecen rojas y las Gram + violeta. Observar (100×). Lugol

Tinción negativa

1. colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo

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