Tinción De Gram

OBJETIVO:

El alumno realizara un exudado faríngeo y posteriormente realizara el método de siembra en placa por estrías.

El alumno realizara una observación de bacterias teñidas mediante una tinción de Gram con el crecimiento bacteriano generado del exudado faríngeo.

INTRODUCCIÓN:

Un cultivo del exudado faríngeo es una prueba que se hace para detectar una infección bacteriana o micótica (por hongos) en la garganta. Se toma una muestra de la garganta con un hisopo y se coloca en un medio de cultivo adecuado (agar) que permite el desarrollo de infecciones. Si se desarrolla una infección, el cultivo es positivo. El tipo de infección se determina utilizando un microscopio, pruebas químicas (tinción de Gram) o ambos. Si no se desarrolla una infección, el cultivo es negativo. (19)

La prueba de exudado faríngeo se realiza tomando una muestra tomada de la pared posterior de la garganta (en el área de las amígdalas) para posteriormente colocar la muestra en el cultivo, el cultivo de la garganta determinaría si el paciente tiene una infección y así ayudarle al médico a determinar el tipo de tratamiento recomendado (13) la garganta posee cierto grupo de bacterias no infecciosas conocidas como flora orofaringe, se ha calculado que el nº total de gérmenes de la flora es mayor al número de células del cuerpo humano.

Aunque este gran número de bacterias representa una amenaza potencial, lo habitual es que mantengan un equilibrio pacífico, aunque delicado, con el huésped. (11)

INOCULACION EN MEDIO DE CULTIVO

Inocular es introducir una porción de muestra en un medio adecuado, con el fin de hacer crecer un cultivo microbiano, una vez sembrado, el cultivo tiene que ser incubado a una temperatura y por un tiempo adecuado para que la muestra crezca correctamente.

Existen diferentes reglas para realizar la inoculación correctamente, debe realizarse de una manera asépticamente, el medio de cultivo y los instrumentos deben estar esterilizados, debe trabajarse lejos de corrientes de aire y cerca de un mechero para que el área de trabajo no sea infectada por agentes externos y la muestra no se vea afectada en su resultado.

Existen diferentes tipos de siembra, de acuerdo al tipo de medio de cultivo utilizado, por ejemplo:

Para medios sólidos:

 Siembra por inmersión: se coloca el inóculo sobre una placa o caja Petri y sobre este se vierte el medio de cultivo fundido

 Siembra de doble capa: se produce igual que el método de inmersión. Una vez que el medio solidifico se vierte una cantidad extra de medio de cultivo

 Siembra en superficie: se vierte sobre la placa el medio de cultivo y una vez solidificado, se coloca sobre la superficie el inoculo y se extiende la muestra hasta que se absorbe por el medio de cultivo

 Siembra en estría: se vierte el medio de cultivo y se deja solidificar, después se realiza un frotis con el objetivo de obtener colonias aisladas

 Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: se coloca medio de cultivo en un tubo de ensayo y se deja enfriar con el tubo inclinado, después se inocula en zigzag.

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TINCION DE GRAM

La tinción de Gram le debe su nombre a Christian Gram, Bacteriólogo Danés, que en 1844 desarrollo este método para diferenciar a las bacterias en dos grupos: Gram+ y Gram-, basándose en las propiedades de su pared celular. (18)

Las bacterias Gram+ se caracterizan por tener una gruesa pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa (8)

Con el método de identificación de tinción de Gram se obtiene información más completa sobre la pared de las células bacterianas. Las bacterias Gram- debido a la delgada pared celular pierden fácilmente el colorante, mientras que la pared gruesa de las Gram+ ayuda a que el colorante se mantenga en el citoplasma a pesar de los lavados realizados durante el desarrollo de la práctica. (10)

En este método de distinción se utilizan como colorantes el Cristal Violeta y la safranina, las bacterias Gram+ obtienen un color azul oscuro dado por el cristal violeta, mientras que las Gram- tienen un color rosa dado por la safranina, después de haberse decolorado con etanol o acetona.

MATERIAL Y SUSTANCIAS:

Hisopo Cristal Violeta Mechero Lugol Incubadora Alcohol-acetona (1:1) Cajas Petri con Agar-Sangre Safranina Portaobjetos Asa de siembra 1 par de Guantes Abatelenguas

Ilustración 2 Material

DESARROLLO EXPERIMENTAL:

1. REALIZAR EL EXUDADO FARINGEO:

a. Quien tome la muestra solicitara al compañero que incline la cabeza hacia atras con la boca bien abierta y bajara la lengua con ayuda del abatelenguas para que pueda introducir el hisopo en el fondo de la garganta.

b. El hisopo se frota con firmeza a lo largo de la parte posterior de la garganta cerca de las amigdalas, se le da vueltas con el fin de que quede todo impregnado. Limpiar el área de trabajo con cloro.

c. Cerca del mechero sembrar por el método de estrias (tres cuadrantes) en la caja petri que contiene agar-Sangre. (puedes apoyarte en la mesa de trabajo).

Ilustración 3 Agar sangre sembrado por el método estrías

d. Incubar las cajas Petri invertidas a 37°C durante 24 horas.

2. REALIZAR LA TINCION DE GRAM

a) Realizar el frotis y fijación:

• Depositar una pequeña gota de solución salina en el portaobjetos.

• Trabajando cerca del mechero, tomar con el asa esterilizada (que tome un color rojo vivo y enfriarse sobre un extremo del agar antes de tomar la muestra) una pequeña parte de una colonia y dispersar en la gota de agua formando una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. El asa debe de volver a esterilizarse una vez que ya se uso.

Ilustración 4 Frotis y fijación

• Con la finalidad de fijar el frotis, una vez que este seco, pasar dos o tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba para no quemarla.

b) Aplicación de los colorantes:

• Poner el portaobjetos sobre un soporte.

• Cubrir con

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