AISLAMIENTO DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: AISLAMIENTO DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

Objetivos:

-Aislar el complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-pro¬teína) a partir de timo de ternera

-Disociar el complejo en sus dos componentes: DNA y pro¬teínas

-Precipitar desoxirribonucleato de sodio.

-Disolver desoxirribonucleato de sodio obtenido.

Introducción

ELECCION DEL TEJIDO

Con el objeto de elegir tejido biológico adecuado para la obtención del ADN, se deben considerar algunos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes:

1) Elevada concentración de ADN.

2) Mínima relación ARN/ADN

3) Baja actividad de ADNasa.

4) Elevado contenido ADN/órgano.

5) Fácil disponibilidad.

6) Bajo costo.

1) Elevada concentración de ADN.

Casi todas las células contienen ADN; excepcionalmente, algunas de ellas carecen de núcleo y también de ADN, como en el caso de los glóbulos rojos de los mamíferos.

En las células nucleadas, la cantidad de ADN varía notablemente en los diferentes tejidos. Como ejemplo, consideremos el contenido de ADN de los diferentes tejidos de una rata adulta:

TEJIDO µg de ADN/100 mg de tejido fresco

músculo esquelético 57

cerebro 123

testículo 230

hígado 240

vesícula seminal 254

corazón 306

riñón 324

páncreas 480

pulmón 710

intestino delgado 1290

bazo 1400

médula ósea 1530

timo 2760

En esta tabla se observa que, en la rata adulta el órgano más rico en ADN es el timo (concentraciones algo menores se encuentran en la médula ósea, el bazo y el intestino delgado.).

2) Mínima relación ARN/ADN:

La presencia de elevadas concentraciones de ARN dificulta el aislamiento del ADN por tratarse de compuestos estrechamente relacio¬nados desde el punto de vista químico.

En general las células vivas contienen una cantidad de ARN con¬siderablemente mayor que la de ADN. Un caso extremo lo constituye el ovocito de los anfibios en el que la relación ARN/ADN es 31,76; en el extremo opuesto podemos ubicar a las células espermáticas que están casi exclusivamente constituidas por ADN. En la siguiente tabla vemos como varía esta relación en los diferentes tejidos de la rata adulta:

TEJIDO ARN/ADN

hígado 3,68

glándula sub-maxilar 1,73

riñón 1,08

bazo 0,335

tejido linfoide 0,285

timo 0,195

Bajo este aspecto, también el timo se encuentra en las mejores condiciones.

3) Baja actividad de ADNasa

Los extractos de distintos tejidos como el hígado, bazo y timo tienen la propiedad de licuar los geles de ADN debido a la presencia de la desoxirribonucleasa, enzima que interviene específicamente en la degradación del ADN; la ADNasa es una fosfodiestearasa altamente específica. Para su acción esta enzima requiere la presencia de ca¬tiones bivalentes; los activadores más específicos son los iones magnesio, manganeso, hierro y cobalto; todos ellos son muy parecidos con respecto a la intensidad de la acción que producen.

Los inconvenientes derivados de la presencia de desoxirribonu¬cleasa en los tejidos puede evitarse mediante el empleo de inhibidores de esta enzima. Entre ellos se encuentran las sustancias que extraen los cationes como los aniones citrato y fluoruro, los agentes que-lantes como el EDTA (etilen diamino tetraacetato) los iones cobre y arseniato, fuertemente inhibidores a una concentración de 0,001 M y el borato a 0,02 M.

4) Elevado contenido en ADN/órgano.

Es muy importante que la concentración del ADN en el tejido sea elevada; pero desde el punto de vista práctico, el material biológico será más ventajoso si la cantidad total del ADN en el órgano es tambi¬én alta. Daremos un ejemplo:

Por lo que se ha visto hasta ahora, el timo es el órgano de la rata que reúne las mejores condiciones para la obtención de ADN; pero éste es un órgano pequeño: pesa aproximadamente 33 mg, por lo tanto se obtiene menos de 1 mg de ADN. En el timo de ternera la concentra¬ción del ADN es aproximadamente la misma (2250 µg ADN/100 mg de tejido), pero tiene un tamaño mucho mayor: pesa aproximadamente 500 g y se pueden obtener de él más de 100 mg de ADN, cantidad para la cual se deberían sacrificar unas 100 ratas adultas.

5) Fácil disponibilidad:

No basta con que el material biológico reúna todas las caracter¬ísticas que vimos anteriormente; es necesario también que sea fácil de obtener en el momento que se necesite. Por ejemplo, el esperma de salmón tiene casi exclusivamente ADN y constituye una excelente mate¬ria prima, pero no es fácil de conseguir. A su vez, el timo de ternera se con¬sigue con mucha facilidad en nuestro país que es típicamente ganadero, pero en EEUU no ocurre lo mismo y resulta más sencillo de conseguir el bazo de cerdo. Es decir, que la elección del tejido depende del lugar donde se trabaja por las posibilidades que se ofrecen de conseguirlo con mayor facilidad.

6) Bajo costo:

En nuestro país el timo de ternero puede conseguirse gratuita¬mente en los mataderos, porque constituye un material de desecho.

CONCLUSION: para obtener ADN en nuestro laboratorio elegimos el timo de ternera vulgarmente llamado molleja de cuello porque reúne todos los requisitos enumerados.

AISLAMIENTO DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO DEL TIMO DE TERNERA

El método consta de los siguientes pasos:

1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-pro¬teína).

2) Disociación del complejo en sus dos componentes: DNA y pro¬teínas.

3) Eliminación de las proteínas.

4) Precipitación del desoxirribonucleato de sodio.

5) Disolución del desoxirribonucleato de sodio obtenido.

FUNDAMENTO.

1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína).

El propósito de esta primera etapa es aislar, en fracciones diferentes, los complejos nucleoprotéicos que se encuentran presentes en el timo de la ternera: la ribonucleoproteína (RNP) y la desoxirri¬bonucleoproteína (dRNP).

Esta separación

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