AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MÉTODOS DIRECTOS.

PRACTICA NO. 5

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MÉTODOS DIRECTOS.

INTRODUCCIÓN.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.

Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza como poblaciones mixtas y para poder caracterizar e identificar un tipo particular de microorganismos, este debe ser aislado y conservado como un cultivo puro o axénico, que significa que está formado por microorganismos de la misma especie. Para el aislamiento de microorganismos se cuentan con varios métodos, los más usados son: el método de la estría cruzada y el método de las diluciones.

El método de la estría cruzada consiste en depositar en un área de la placa de medio de cultivo sólido una asada de la muestra o cultivo mixto que sirve de inóculo, se extiende el inóculo con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente a una distancia de 1 a 2 centímetros de la orilla. Se esteriliza el asa, se deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estrías. Se gira la caja Petri 1/5 de la vuelta y con el asa esterilizada se hace una nueva serie de estrías que deben extender una pequeña porción de la pequeña serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el centro. La operación se repite dos veces más y en la quinta se hace una serie de estrías abiertas que termine en o cerca de centro, cuidando que no se toque las estrías anteriores.

El método delas diluciones consiste en hacer una serie de diluciones, generalmente decimales, de las cuales se toman alícuotas que se siembran en medios de cultivos sólidos ya sea depositando la alícuota en la superficie y dispersándola uniformemente con una varilla de vidrio; o bien mezclando la alícuota con un medio de cultivo fundido en un tubo y enfriado a 45° C y vaciando inmediatamente en una caja Petri estéril.

Las colonias aisladas presentan características morfológicas diferentes debido a que cada grupo filogenético de microorganismos tienen características peculiares que se ven influidas por las condiciones del medio. Una colonia se desarrolla en un medio sólido y procede de una sola bacteria, espora o agrupación de microorganismos de la misma especie, a los que se les denomina unidades formadoras de colonias (UFC).

Para determinar el número de UFC en una muestra procesada por el método de las diluciones se cuenta el número de colonias formadas en las placas, de preferencia aquellas que tengan entre 30 y 300, se calcula el número de UFC contenidas en un mililitro de la dilución usada para inocular cada placa y se multiplica por la inversa de la dilución correspondiente.

No todas las bacterias viables presentes en una muestra pueden cultivarse in vitro; dependiendo de la muestra, se estima que solamente crecen en los diferentes medios de cultivo entre un 20 y 50% de las especies presentes. Esto es debido a que algunas de ellas viven en simbiosis obligada, o son inhibidas por otros microorganismos presentes, o en los medios usados crecen muy lentamente, o son inhibidas por los componentes de los medios de cultivo, o tienen requerimientos nutricionales que el medio de cultivo no les proporciona, etc.

También para el éxito del aislamiento de microorganismos a partir de muestras de ambientes naturales se pueden requerir de medios de transporte especiales o de técnicas de enriquecimiento previas, y cultivo en medios ricos, selectivos o diferenciales.

El oxígeno puede ser esencial para algunos microorganismos, pero tóxico para otros. La capacidad de los microorganismos para crecer en presencia o ausencia de oxígeno, está directamente relacionada con su metabolismo y con la presencia o ausencia de enzimas que los protegen del efecto tóxico de los productos del oxígeno (por ejemplo, su peróxido dismutasa y catalasa). Con base en los requerimientos de oxígeno, los microorganismos se han agrupado en: aerobios estrictos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos, anaerobios Aero tolerantes y microaerofílicos.

Los microorganismos aerobios estrictos respiran usando el oxígeno como aceptor final de electrones en su cadena respiratoria; los anaerobios facultativos pueden obtener su energía tanto por procesos respiratorios como fermentativos, es decir, tener como aceptores finales de electrones al oxígeno o compuestos orgánicos. Los microorganismos microaerofílicos requieren oxígeno pero a tensiones menores de 15%.

CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

La estimación de la población microbiana por métodos directos, se ha empleado en forma usual por diferentes investigadores. Los métodos que se han descrito se pueden adaptar a diversos tipos de hábitat. Por otro lado, la observación directa de microorganismo en muestras de suelo y agua, permiten conocer el tipo, la forma y las posibles agrupaciones de los diferentes microorganismos de la comunidad.

Las cuantificaciones de microorganismos realizadas por métodos directos, en general permiten obtener valores más elevados con respectos a las determinaciones de cuenta viable. Esto es debido a que se incluyen células no viables y aún aquellas que no pueden crecer en los medios de cultivos usuales empleados en el laboratorio.

Los métodos directos para cuenta de microorganismos empleados en estudios preliminares resultan complementarios a los métodos indirectos, lográndose así obtener resultados de mayor confiabilidad.

OBJETIVO

Aprende y practicar las técnicas de aislamiento por medio de la estría cruzada y el método de las diluciones.

Aplicar técnicas de cuantificación por observación microscópica directa para determinar la abundancia relativa de microorganismos en muestras de suelo y agua.

MATERIAL

a) BIOLÓGICO

 Muestras de suelo

 Muestras de agua

Para una correcta toma de las muestras consultar el apéndice No. 1 inciso a) correspondiente a las técnicas de muestreo y procesamiento de muestras.

b) MEDIOS DE CULTIVO, SOLUCIONES Y REACTIVOS

 Tubos de ensaye conteniendo 9 ml de una solución de agar al 0.15% estéril.

 Tubos de ensaye conteniendo 9 ml de solución salina estéril.

 Frascos de dilución con 90 ml de solución salina estéril.

 Soluciones colorante de: cristal violeta, safranina, azul de metileno.

 Cajas de Petri con gelosa nutritiva o agar cuenta estándar

 Etanol comercial

c) VIDRIERIA Y DIVERSOS

 Pipetas serológicas estériles de 1 ml de capacidad

 Tubos de 16 x 150 mm estériles

 Pipetas de 1 y 10 ml estériles

 Propipeta

 Micropipetas

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