ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MUESTRAS NATURALES

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MUESTRAS NATURALES.

Técnicas de aislamiento, cultivo puro. Medios de cultivo selectivos y diferenciales.

Los microorganismos se hallan ampliamente difundidos en la Naturaleza y uno de los procedimientos microbiológicos fundamentales consiste en aislar los gérmenes presentes en una determinada muestra.

Las técnicas utilizadas para realizar los aislamientos, dependen del tipo de muestra y de los microorganismos que pudieran estar presentes en la misma. Así, el estado físico de la muestra, su procedencia, la cantidad y tipos de bacterias presentes etc. determinarán los procedimientos a seguir. Estos procedimientos incluirán una adecuada toma de muestra, su debido procesamiento previo al aislamiento (ej.: dispersión de muestras sólidas en medios acuosos adecuados) y la etapa de aislamiento en sí.

Técnicas de aislamiento

Si se coloca un solo microorganismo viable sobre la superficie de un medio sólido adecuado para su desarrollo se verá, luego de la incubación, que ha tenido lugar un desarrollo macroscópico. Este desarrollo visible se denomina colonia, y es el resultado de gran cantidad de divisiones celulares a partir del organismo inicial.

Supongamos que de una muestra líquida que contenga un gran número de un medio sólido contenido en una caja de Petri, de manera tal que las bacterias se "diluyan" en el área sembrada.

En alguna de las zonas, las bacterias habrán quedado lo suficientemente separadas como para formar colonias aisladas.

En la figura puede apreciarse un esquema de una de las técnicas más utilizadas para el aislamiento de microorganismos.

Los pasos a seguir se detallan a continuación: se toma parte de la muestra con una ansa, se disemina en un sector de la superficie del medio sólido, se flamea el ansa y se vuelve a tomar muestra de la superficie del medio. Este procedimiento se repite hasta que ya no queda espacio para realizar nuevas estrías.

En el esquema mostrado en la figura la muestra original se descarga inicialmente en las estrías de la zona 1, se flamea el ansa se toma muestra de un sector de la zona 1 y se disemina sobre la zona 2. El procedimiento continúa de la misma manera en otros sectores.

Como la finalidad del aislamiento es la obtención de cultivos puros, es decir que estén compuestos por un solo tipo de microorganismos, es práctica común realizar sucesivos aislamientos a partir de las colonias obtenidas en los distintos pasos.

En algunas ocasiones, los microorganismos a aislar están en una concentración tan baja que es altamente improbable que al introducir un ansa en la misma se extraiga algún microorganismo.

Supongamos una muestra líquida con 10 microorganismos/ml y perfectamente homogeneizada.

Si tomamos el volumen de un ansa en anillo (aproximadamente 5 µl), la probabilidad de no extraer microorganismos será p (0)= e-0,005x10= 0,95. Es decir que la probabilidad de extraer uno o más microorganismos será del 5%. En el caso anteriormente descripto se hace necesario concentrar los microorganismos. Esto puede lograrse mediante dos técnicas:

a) Filtración con membranas:

Un volumen adecuado de la muestra líquida, se filtra a través de una membrana de 0,45µm de diámetro de poro y luego se coloca la misma sobre un medio de cultivo sólido, que permita el desarrollo de los microorganismos buscados. Luego de la incubación se formarán colonias que pueden someterse a nuevos pasos de aislamiento.

b) Enriquecimiento en medios líquidos:

Para muestras no filtrables se hace necesario recurrir a técnicas de enriquecimiento en las que se busca aumentar la concentración de los microorganismos a aislar.

En los métodos de enriquecimiento, se coloca en medio líquido una cantidad de muestra que contenga con seguridad uno o más microorganismos viables, se incuba para permitir el crecimiento y luego, cuando hay una cantidad suficiente de microorganismos, se extrae una porción con un ansa y se realizan estrías sobre un medio sólido.

En general, suelen utilizarse medios de cultivo selectivos para favorecer el desarrollo de la población microbiana deseada.

Los medios sólidos utilizados luego del enriquecimiento pueden ser selectivos o no. La utilización de diferentes medios para las técnicas de aislamiento (selectivos, diferenciales, etc.) permite obtener los microorganismos buscados independientemente de la complejidad de la muestra.

TRABAJO EXPERIMENTAL

Objetivos:

- Análisis cuantitativo de poblaciones bacterianas de muestras naturales.

- Aislamiento de microorganismos pertenecientes a los géneros y especie Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Escherichia coli, utilizando las técnicas de aislamiento directo y aislamiento con enriquecimiento previo.

TIERRA

Para el análisis cuanti y cualitativo de la muestra de tierra proceder pesando 10g de tierra y suspender en 100 ml de solución fisiológica (0,85g % de NaCl). Extraer en agitación suave (180 rpm) durante 30 min. Retirar del agitador y dejar sedimentar 10 min.

Realizar las siguientes determinaciones a partir del sobrenadante.

a) Recuento de bacterias Heterótrofas totales: realizar diluciones seriadas de la muestra homogeneizada en solución fisiológica estéril. Las diluciones a sembrar deben ser ajustadas según el origen de la muestra.

Posteriormente, sembrar 0,1 ml de las diluciones adecuadas en superficie de agar nutritivo, distribuir con la espátula de Drigalsky estéril e incubar a 37ºC durante 24-48 hs.

Realizar el recuento de las colonias desarrolladas en las correspondientes diluciones y calcular el número de UFC/g de tierra.

b) Para el aislamiento directo, sembrar con ansa, utilizando la técnica de aislamiento, una placa de agar nutritivo, una placa de agar cetrimide, una placa de agar Mossel y una de agar EMB. Incubar 48hs a 32ºC y la caja de EMB a 37ºC.

c) Para los enriquecimientos, inocular los siguientes medios líquidos, según las proporciones indicadas: caldo nutritivo suplementado con polimixina (1/10), caldo nutritivo o agua peptonada (1/10) y caldo Mac Conkey (1/10). Incubar el

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