Articulo De Mutagenesis

Revista médica de Chile

Versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. Méd. Chile v.132 n.8 Santiago ago. 2004; 132: 955-960

Doi: 10.4067/S0034-98872004000800007

Artículo de Investigación

Mutación del gen K-ras en el cáncer de la vesícula biliar

Juan Carlos Roa S1, Iván Roa E1, Xabier de Aretxabala U2, Angélica Melo A1, Gaspar Faría O2, Oscar Tapia E1.

Departamentos de Anatomía Patológica1 y Cirugía2, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera.

Introducción

La familia de genes ras (H-ras, N-ras y K-ras) es uno de los grupos de oncogenes más frecuentemente alterados en las neoplasias humanas24,25. Las proteínas codificadas por estos genes se ensamblan entre sí, conformando una estructura proteica con un peso de 21Kd que le otorga el nombre (p21). Poseen actividad GTP-asa, participan en la vía de transducción de señales de crecimiento y diferenciación celular25,26. Las proteínas p21 mutadas se activan constitutivamente y estimulan el crecimiento y la diferenciación de manera autónoma. En alrededor del 80% de las mutaciones observadas en el gen K-ras se localizan en el codón 12 y, en menor frecuencia, en los codones 13, 60, 61. La mutación del codón 12 ocurre en el segundo nucleótido y corresponden predominantemente a transiciones (guanina-adenina) con sustitución de ácido aspártico por glicina27,28.

En el cáncer de la vesícula biliar en pacientes sin anomalías en la unión pancreático-biliar, se han comunicado porcentajes de mutación del gen K-ras que fluctúan entre el 0% y 60%. Las diferencias mencionadas en los porcentajes de activación de K-ras sobrepasan lo que pudiese esperarse producto de las variaciones propias de los tumores10, pudiendo ser atribuidas al uso de diferentes técnicas empleadas más que a las variaciones de las poblaciones bajo estudio. Se ha utilizado por ejemplo, detección y tipificación de mutaciones en el gen K-ras mediante PCR combinada con el uso de enzimas de restricción (RFLP)30, como también mediante polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP)33 o electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE)34 seguido de secuenciación35. Cada uno de estos métodos con distinta sensibilidad. En el espectro de los resultados, hay autores que no han demostrado mutación de este gen, otros, en cambio, muestran cifras de mutación de entre 50% y 60% en los cánceres vesiculares y le asignan una importante participación en la carcinogénesis vesicular16,31,36.

El objetivo de este trabajo es determinar la presencia de mutaciones en el codón 12 del gen K-ras en carcinomas avanzados de la vesícula biliar mediante reacción de polimerasa en cadena (PCR) en seminido y RFLP (Restriction fragment length polymorphism).

Material y Método

Casos. Se incluyeron 33 casos de cáncer avanzado de la vesícula biliar de la Unidad de Anatomía Patológica del Hospital Temuco. En todos los casos, el nivel máximo de infiltración tumoral fue establecido mediante el mapeo completo de la pieza quirúrgica. Como controles se utilizó casos de cáncer de páncreas en los que previamente se había demostrado la mutación del codón 12 del gen K-ras.

Extracción del ADN. Se realizó microdisección manual en 5 cortes histológicos con áreas representativas del tumor. El ADN fue extraído con el Kt Puregene™ DNA Isolation System (Gentra Systems, USA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

El ADN se almacenó a -20°C hasta su análisis. En todos los casos se realizó amplificación previa del gen ß-globina para verificar su calidad.

Detección de mutaciones del codón 12 del gen K-ras. Se utilizó un PCR en seminido y RFLP, con iniciadores previamente reportados en la literatura40. Estos iniciadores («primers») permiten amplificar un fragmento del gen K-ras que incluye un sitio de restricción para la enzima MvaI. Las secuencias de los iniciadores y los tamaños de los fragmentos se muestran en la Tabla 1. Tanto los productos PCR (pPCR) de la primera como de la segunda amplificación, fueron digeridos con la enzima MvaI (10 U para 20 ul pPCR). El iniciador K-ras-A tiene una base cambiada con respecto a la secuencia del gen K-ras, esto produce un sitio de restricción para la enzima MvaI cuando el codón 12 es normal. También el iniciador K-ras-B tiene una base cambiada, lo que lo hace susceptible de digestión por la enzima MvaI y de esta manera no interfiere en la 2ª amplificación.

Los pPCR de la segunda amplificación fueron corridos en un gel al 10% de poliacrilamida (1:29), Buffer TBE 1X, Glicerol 5% a 150 volt por 2 h y posteriormente teñidos con bromuro de etidio.

Controles

Como control positivo, se empleó ADN de carcinomas de páncreas en los que previamente se había demostrado la mutación del K-ras en el codón 12.

Como control negativo se usó DNA genómico comercial (Promega) y como control blanco se sustituyó el ADN por agua deionizada.

Resultados

Las características generales del grupo estudiado se resumen en la Tabla 2. La mayoría de los casos correspondieron a mujeres (90%) con un promedio de edad de 55,1 años (DS 14,6). La totalidad de los casos correspondieron a adenocarcinomas avanzados (subserosos o serosos) y en su gran

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