BACTERIOLOGÍA PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 01

UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN” –TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS: E.A.P DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA

CURSO: BACTERIOLOGÍA

PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 01

TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

I. INTRODUCCIÓN

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de las células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

Por lo tanto, la clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

II. OBJETIVOS

1. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram.
2. Caracterizar e identificar a las bacterias Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a su forma y disposición.
3. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias

III. MATERIALES

• Microscopios
• Mecheros
• Asas de platino
• Set Colorantes Gram
• Lámina portaobjetos
• Aceite de inmersión
• Alcohol isoprópilico
• Gradilla porta láminas
• Pizeta con agua destilada
• Papel seda
• Hisopos
• Alcohol desinfectante
• Plumón indeleble.

Cultivos bacterianos: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Neisseria spp.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS FRESCAS

1. Dos o Tres alumnos voluntarios: tres días antes de la práctica no lavarse ni cepillarse la boca con pasta dental u otra sustancia.
2. Dos o tres alumnos voluntarios deberán traer una muestra de sus propias heces.

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Primer caso: cada alumno voluntario deberá hacer un enjuague o lavado bucal con S.S.F.E. Si, se observa detritus en el vaso de precipitación se hará un filtrado; luego, se procederá a la extensión en una lámina portaobjetos y colorear con Gram.

Segundo caso: cada alumno voluntario diluirá las heces en tubos de ensayo con 10 mL de S.S.F.E o agua destilada; luego, realizar filtrado de cada uno de las muestras y, finalmente, extender en lámina portaobjetos y colorear con Gram.

IV. PROCEDIMIENTO

1. Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.
2. Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente. Tomar material de la colonia elegida, con un ansa previamente esterilizada a la llama y suspender este material en una gota de agua colocada en la mitad del portaobjetos. Extender el material sobre toda la superficie del portaobjeto.
3. Fijar con calor pasando el preparado por sobre la llama SIN QUEMARLO.
4. Cubrir el extendido con una solución del colorante cristal violeta. Dejar en contacto 60 segundos.
5. Decantar el colorante. Cubrir con solución de lugol. Dejar en contacto durante 2 minutos.
6. Decolorar con alcohol-acetona (exhaustivamente). Lavar con agua.
7. Cubrir con safranina (colorante de contraste). Dejar en contacto 20 segundos. Lavar con agua.
8. Secar y observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión.

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Figura 1. Fotomicrografía donde se observan bacterias Gram negativas en cultivo directo (izquierda) y Gram positivas en hemocultivo (derecha) (aumento 100x).

TINCIONES ESTRUCTURALES

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