BIOANALISIS TECNICAS DE COLORACION

Introducción

Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante.

Los colorantes pueden ser de distintos tipos:

Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: azul de metileno.

Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: eosina.

Técnica de coloración de Giemsa

Es la segunda coloración en uso, luego de la tinción de Wright, y en importancia de las mezclas de Romanowsky. Es quizás la mejor modificación de este tipo de coloraciones para descubrir parásitos en la sangre, como en el caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi).

El colorante de Giemsa también da excelentes resultados para la tinción rutinaria de frotis sanguíneos. Cuando se va a teñir con este colorante, debe fijarse primero la muestra con metanol absoluto por un tiempo mínimo de tres minutos (cuando la preparación no incluye metanol). El colorante en solución nunca se utiliza de manera directa, por lo que se debe diluir con la solución amortiguadora en una proporción de 1:10 ó 1:20 y el tiempo de coloración podrá ser de 10 ó 20 minutos, respectivamente.

Muestra

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. El anticoagulante de elección es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar preparaciones defectuosas.

Material adicional requerido

• Microscopio óptico.

• Portas Objetos bien limpios.

• Cristalizador.

• Puentes de tinción.

• Pipetas Pasteur con chupete.

• Frascos lavadores.

• Tubos de ensayo.

Reactivos

Azur-Eosina-Azul de Metileno solución según Giemsa (lento) DC (*)

Metanol PRS-CODEX

Aceite de Inmersión DC (*)

Tampón, Solución pH 7,2 DC

Técnica

• Preparamos un frotis sanguíneo

• Colocamos el frotis sobre el puente de tinción, en el cristalizador y en posición horizontal.

• Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis.

• Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2. Es importante realizar esta dilución en el momento de la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para otro día.

• Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis con la dilución de colorante, dejándolo actuar durante 25 minutos.

• Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical.

Resultados

Eritrocitos Rosa-asalmonado

Plaquetas Violeta

Tipo de leucocito Núcleo Citoplasma granulaciones

neutrófilos Violeta a rojizo Violeta

eosinófilos Violeta a rojizo Rojo ladrillo a pardo rojizo

basófilos Violeta a rojizo Violeta oscuro a negro

monocito Violeta a rojizo Azul-grisáceo

linfocito Violeta a Azul

Tinción de Wright

Esta coloración es conocida como policromática debido a que produce varios colores.

Es una solución de alcohol metílico de un colorante ácido (eosina) y otro básico (azul de metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguíneo al portaobjetos. El amortiguador, que consiste en una solución tamponada, mantiene el pH del colorante y favorece la mejor absorción por los diferentes componentes celulares.

Muestra

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes más adecuados son la heparina y el EDTA.

Materiales:

• Microscopio óptico.

• Cristalizador.

• Puentes de tinción.

• Pipetas Pasteur con chupete.

• Frasco lavador.

• Guantes.

• Tubos de ensayo.

Reactivos

• Solución de eosina-azul de metileno según Wright.

• Solución tampón pH 7,2.

• Aceite de inmersión.

Técnica

Realizar un frotis sanguíneo muy fino. Dejar secar al aire.

Sobre la extensión colocada horizontalmente en el puente de tinción verter 1 ml de eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.

Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solución tampón pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilución la extensión. Teñimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del grifo. Volvemos a lavar con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.

Resultados:

• Los eritrocitos se observarán de color naranja o rosado.

• El citoplasma de los monocitos presentarán una tonalidad azul grisácea con gránulo rojizos bastante finos y sus vacuolas características. El citoplasma de los linfocitos presentará varias tonalidades azules.

• Los núcleos de los linfocitos y neutrófilos aparecerán de color púrpura oscuro. Los núcleos de los monocitos de color púrpura algo más claros (lila).

• Los gránulos de los eosinófilos son de color rojo-anaranjado intenso. Los gránulos de los basófilos púrpura azulado muy oscuro. Los gránulos de los neutrófilos se aprecian de color lila, bastante finos.

• Las plaquetas toman coloración violeta o púrpura

Técnica de Coloración del Cresil Brillante

Ellos se evidencian sobre unos frotis gracias a ciertos colorantes supravitales como el azul de metileno o azul de cresil brillante, que permite observar los organoides citoplasmáticos que aún llevan y que han desaparecido en los glóbulos rojos adultos: es la <<sustancia reticulofilamentosa. La técnica ha de realizarse a ser posible antes de que transcurra 2 horas de la extracción, con un máximo de 24 horas.

Puede apreciarse sobre un porta objeto el porcentaje de glóbulos rojos que son reticulocitos, pero es deseable expresar los resultados en valores absolutos, así pues como el ciclo vital de un hematíes es de 120 días,

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