BIOLOGIA

ACUMULACIÓN DE UN SUBCONJUNTO DE MONOCITOS EN EL CORAZÓN HUMANO DESPUÉS DE UN INFARTO AGUDO AL MIOCARDIO Y LA FUNCIÓN DEL BAZO COMO DEPÓSITO DE MONOCITOS

INTRODUCCIÓN

En los pacientes con infarto agudo de miocardio (IAM), una respuesta de curación adecuada es crucial para la preservación de la geometría y función ventricular izquierda (LV), y por lo tanto la prevención de la remodelación del VI adverso. La curación del infarto es un proceso complejo y dinámico, que consiste en una sustitución de miocardio necrótico con el tejido de la cicatriz, y está mediada críticamente por los monocitos. En consecuencia, los monocitos han llamado recientemente la atención considerable como un objetivo para mejorar la reparación post-IAM.

Los monocitos de sangre periférica en humanos son una piscina heterogénea de células, que consiste en al menos dos subconjuntos, monocitos CD14+ CD16- y CD14+ CD16+, que tienen características únicas con respecto al fenotipo y la función. Aunque los monocitos circulantes, una vez que se infiltraron en el miocardio infartado, se denominan generalmente como macrófagos, los resultados de los estudios en ratones indican que los monocitos pueden tener distintos destinos. Es decir, los monocitos infiltrados, al llevar adelante sus funciones, puede eventualmente diferenciarse en macrófagos, emigran desde el lugar de la lesión, o mueren por apoptosis o necrosis, y se reponen rápidamente por los monocitos recién liberados. Se ha demostrado recientemente, después de la ligadura coronaria en ratones, que una gran proporción de estos monocitos recién liberados es proporcionada por el bazo, sugiriendo una función de reservorio extramedular único para los monocitos.

Si bien los monocitos median críticamente curación del infarto, hay un creciente cuerpo de evidencia que indica que la respuesta de los monocitos incontrolada puede afectar la cicatrización post-IAM y directamente afectar el pronóstico. En los pacientes con IAM, los niveles sanguíneos pico de monocitos CD14+ CD16- son en el día 3, mientras que la de monocitos CD14+ CD16+ es en el Día 5. Varios estudios clínicos informaron que los pacientes con niveles altos de monocitos CD14+ CD16- siguientes a IAM muestran pobre resultado funcional, lo que sugiere que la liberación excesiva particularmente de monocitos CD14+ CD16- puede mejorar la lesión post-IAM. Sin embargo, no queda claro si los cambios dinámicos de los niveles de subconjuntos de monocitos, observados en la sangre, reflejan la presencia de la célula en el tejido infartado.

Hasta el momento, los estudios en animales han aportado importantes conocimientos sobre el origen, la fuente, la liberación, y las funciones de los monocitos en la curación post-IAM, y estudios clínicos, incluso han proporcionado un fundamento para futuras estrategias terapéuticas. Sin embargo, los datos histológicos de los pacientes son insuficientes. Para abordar estas cuestiones, se realizaron análisis histológicos detallados de los materiales de la autopsia clínica para hacerse una idea de la respuesta de los monocitos sistémica después de IAM en los pacientes.

MÉTODOS

Pacientes, colección de tejido y procesamiento

Un total de 40 pacientes que fueron remitidos al Departamento de Patología de la VU University Medical Centre (VUMC; Amsterdam, Holanda) para la autopsia clínica se incluyeron en este estudio. Se realizó la autopsia clínica dentro de las 24 h después de la muerte. Veintiocho pacientes fueron diagnosticados en la autopsia clínica con reciente IAM del ventrículo izquierdo. Todos estos pacientes mostraron evidencia macroscópica de reciente IAM del ventrículo izquierdo, identificados por la decoloración con lactato deshidrogenasa (LDH) del tejido lesionado infartado. El corazón a nivel macroscópico fue fotografiado, y decoloraron la superficie de la zona con LDH en relación a la del ventrículo izquierdo y el tabique, y se utilizó para determinar el porcentaje del tamaño del infarto. Además, sobre la base de decoloración con LDH, el área de infarto de miocardio fue clasificado como subendocárdica o transmural. Doce pacientes, que murieron por una causa no relacionada con IAM, y por lo tanto, con la tinción de LDH normal, macroscópica, sirvieron como controles. Todos los pacientes excepto uno con evidencia de sepsis, miocarditis, el cáncer con metástasis, el reciente accidente cerebrovascular o embolia pulmonar reciente fueron excluidos, como se conoce a estas condiciones de influir en el número de monocitos en el miocardio, el bazo o médula ósea. Un paciente murió inmediatamente después de gran embolia pulmonar en la parte proximal de la arteria pulmonar, indicativo de la muerte súbita, y por lo tanto se incluyó en el grupo de control. Además, el tejido pulmonar se examinó para evidencia histopatológica de la neumonía en el momento de la muerte. El presente estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki. El protocolo del estudio (Casimiro) fue aprobado por el Comité de Investigación del Departamento de Patología de la VUMC. El uso de material de autopsia después de la finalización del proceso de diagnóstico es parte del contrato del paciente en el VUMC.

Muestras de tejido miocárdico se obtuvieron desde el centro del área del infarto (ventrículo izquierdo) en pacientes con IAM, identificados por decoloración LDH (Figura 1). En los pacientes de control, las muestras de tejido se obtuvieron a partir de miocardio del ventrículo izquierdo. De cada paciente, también una muestra de tejido de un cuerpo vertebral torácico (médula ósea) y de la parte subcapsular del bazo se recogió, ya que esta zona se informó previamente para ser el sitio de un depósito monocítico en ratones. Las muestras de tejido fueron fijadas con formalina y embebidas en parafina para análisis inmunohistoquímicos. Muestras del tejido de miocardio de 19 pacientes con IAM también fueron congelados y almacenados a -196 ° C (N2 líquido) para los análisis de inmunofluorescencia.

Pacientes con IAM se clasificaron en tres fases de curación post-IAM basado en criterios microscópicos: la primera fase post-IAM (decoloración macroscópicamente con LDH pero sin extravasación de granulocitos neutrófilos en la zona del infarto; n = 9), la fase inflamatoria post-IAM (extravasación de granulocitos neutrófilos en la zona del infarto; n = 9), y la fase proliferativa post-AMI (formación de tejido de granulación; n = 10), que corresponden a una edad de 3-12 h del infarto después de un IAM, 12 h-5 días después de IAM, y 5-14 días después de IAM, respectivamente.

Para identificar la enfermedad de múltiples vasos, las coloraciones de hematoxilina y eosina de las tres arterias coronarias (arteria descendente anterior izquierda, la arteria circunfleja y la arteria coronaria derecha) se utilizaron para determinar microscópicamente la tasa de estenosis de la arteria. Los pacientes que contenían dos o tres arterias coronarias con estenosis >50% fueron clasificados como que contienen la enfermedad de múltiples vasos.

Inmunoquímica

Las secciones rehidratadas del miocardio, el bazo y la médula ósea se incubaron en metanol/H2O2 (0,3%) durante 30 min para bloquear las peroxidasas endógenas. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por calentamiento en tampón Tris-EDTA (pH 9,0). Las secciones fueron incubadas con CD14 anti-humano. La inmunotinción fue revelada utilizando el kit de detección EnVision. La tinción se visualizó usando 3,3'-diaminobenzidina (0,1 mg/ml, 0,02% H2O2), y las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron, y se cubrieron. Para los controles negativos, el anticuerpo primario fue sustituido por solución salina con fosfato. Estas secciones se encuentran todas negativas.

Los monocitos se identificaron como células CD14+. Se encontraron células endoteliales y neutrófilos a teñir negativos para CD14-. Las secciones teñidas de tejido miocárdico fueron escaneados con un sistema de escáner de laminillas MIRAX utilizando un objetivo 20×. El número de células CD14+ se determinaron y se equiparó a las zonas. En particular, en el área de infartos de fase inflamatoria e infartos de fase proliferativa se pueden identificar dos áreas. Hemos definido el núcleo del infarto microscópico como el área que consta de tejido necrótico de infiltrarse en los granulocitos neutrófilos en los infartos de fase inflamatoria y de tejido de granulación en los infartos de fase proliferativa. La zona fronteriza al microscópico se define como el área adyacente al núcleo del infarto microscópico, que contiene los cardiomiocitos viables. En secciones de tejido teñidas en el bazo, el número de células CD14+ fueron cuantificadas por área de superficie, que se midió utilizando Q-Prodit. En las secciones de coloración de la médula ósea, el número de células CD14+ se determinaron en un mínimo de 10 campos de gran aumento (400× aumento).

Inmunofluorescencia

Las secciones de tejidos de miocardio congeladas se fijaron en paraformaldehído al 3%, seguido de incubación con 10% de suero normal de cabra. Los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios a 48°C: CD14- de ratón anti-humano, CD16- de ratón anti-humano; a-actinina de ratón anti-humano; C3b de conejo anti-humano. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados: de cabra anti-ratón IgG2a Alexa Fluor 488; anti-ratón de cabra IgG1 Alexa Fluor 647; de cabra anti-ratón IgG1 Alexa Fluor 568; IgG de cabra anti-conejo (H+L) Alexa Fluor 568, y se contratiñeron con Hoechst 33342.

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