COMO SE DA EL DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
LA MOLINA

[pic 1]

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

Informe N°2

Título: Tinción Diferencial de Gram

Integrantes:

Aguirre Bottger, Cosette Nicole             Neira Chacate, Gonzalo Jose Manuel Rodríguez Zevallos, Daniel Ernesto

Yarasca Colca, Dalia Julieta

20160090

20160112

20160114

20150120        

Mesa N°1

LA MOLINA – LIMA – PERÚ

2018

1. Introducción

Desde los inicios de la bacteriología, la coloración Gram se ha convertido en una herramienta fundamental, tal metodología fue trabajada por el danés Hans Christian Joachim Gram    quien enfatizó su trabajado en una publicación realizada el 15 de marzo de 1884. Posteriormente, el conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, en cuanto fisiología y composición molecular demostraron que la coloración Gram distingue dos grupos de bacterias muy diferentes. Las bacterias Grampositivas que presentan una gruesa capa de peptidoglicano, y las Gramnegativos con una delgada capa de peptidoglicano a la que se le superpone una capa de lipopolisacárido lipoproteína, denominada membrana externa (Morales, 2013).

La tinción Gram actualmente tiene gran relevancia en el diagnóstico microbiano a niveles clínicos, debido a que permite un primer vistazo para diferenciar la morfología y taxonomía de las cepas bacterianas infecciosas. Es denominado tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes, a su vez clasifica a las bacterias en dos grandes grupos previamente mencionados. En su realización, al igual que la tinción simple se necesita realizar un correcto frotis antes de su proceso, con la finalidad de preservar la arquitectura estructural y química de las células. Es denominado tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes, a su vez clasifica a las bacterias en dos grandes grupos previamente mencionados (López, 2014).

Las desventajas de este procedimiento radica en el hecho de que no todas las bacterias corresponden a estas dos catalogaciones, existen algunas que no son afines a dicha tinción así como otros son bipolares por lo que la diferenciación entre ambos es confusa, también existen algunas bacterias que por la peculiaridad de sus membranas pierden rápidamente los colorantes (García, 1994)

1. Objetivos

• Aplicar correctamente la tinción diferencial de Gram
• Demostrar la existencia de dos grupos principales de bacterias por medio de la tinción diferencial de Gram

1. Marco Teórico

Tinción Diferencial

La tinción diferencial es aquella que utiliza más de un colorante en múltiples pasos para teñir de colores diferentes a las células de diferentes tipos, a diferencia de la simple que utiliza un solo colorante en un solo paso y tiñe de manera global. Por ende, ésta tinción permite efectuar análisis básicos o generales (Madigan; et. al, 2009). La tinción puede estar orientado hacia estructuras específicas, como hacia la cápsula bacteriana, la endospora, o hacia el flagelo. También puede clasificar a las bacterias según sus características, como la tinción hacia los ácido-alcohol resistente y, el más conocido, la tinción Gram (Ríos, 2016). El Esquema 1 plasma las diferencias y similitudes entre la tinción diferencial y simple.

Esquema 1.: Contraste entre la tinción simple y diferencial

Tinción Gram

La tinción Gram consta de la tinción por un colorante primario (cristal violeta), seguido de la aplicación de un mordiente para intensificar el color. Luego, se procede a la decoloración con alcohol cetona, y finalmente se aplica el colorante secundario (safranina). Esto permite dividir a las bacterias en grampositivas o gramnegativas, según el colorante que retienen al finalizar la tinción. Las primeras retienen el colorante primario utilizado, mientras que las últimas, el secundario. Esta diferencia se debe a la composición de la pared celular en las bacterias, específicamente por la capa de peptidoglicano. Las bacterias grampositivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano, la cual se deshidrata por el alcohol e impide la salida del complejo coloreado cristal violeta-yodo formado por el primer colorante, ya que sus poros se cierran. Por el contrario, las gramnegavitas poseen una fina capa de peptidoglicano, la cual no restringe la extracción del complejo coloreado por parte del alcohol, entonces, perdiendo el color. Por ende, éstas se podrán volver a teñir con el segundo colorante (Madigan; et. al, 2009).

Reactivos Usados en la Tinción Diferencial de Gram

• Cristal Violeta: Es un componente primario de tinción que sirve para fijar los compuestos microscópicos. Este, por su naturaleza positiva (colorante catiónico) presenta afinidad por las bacterias, que se caracterizan por tener una carga negativa, ya que se adhiere a la pared celular bacteriana y se acumula en el citoplasma en las bacterias.en el caso de las gram positivas absorben este colorante con mayor afinidad porque tienen mayor porcentaje de ácido teicoico en su estructura y por eso adquieren un color violeta en el microscopio, por lo tanto como colorante primario cumple como función permitir la identificación de bacterias cuya estructura y composición de pared celular se encuentre mayor proporción y distribución de ácido teicoico.

• Lugol: Aplicado en exceso luego de lavar el cristal violeta restante de la muestra. Esta solución mordiente (Lugol) actúa como un fijador ya que ayuda a que el colorante se fije a las correspondientes estructuras microbianas, reforzando la acción tintorial, esto porque aumenta la afinidad del primer colorante a las células (Granado & Villaverde, 2003). El colorante básico - mordiente queda atrapado en las bacterias grampositivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza físico - química de su pared. Por el contrario en las gram negativas es arrastrado debido a su alto contenido lipídico (Pumarola, Rodriguez, García, & Piédrola, 1987).

• Alcohol Cetona: El paso más importante de la tinción pues en este proceso se diferencia las bacterias ya que es el  agente decolorante, sustancia en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, es debido a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/cetona (Gamazo, López-Goñi, & Díaz, 2005). La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea. En el caso de las gram negativas el colorante inicial no está completamente fijado a la estructura, por diferencia de afinidades, será retirado o arrastrado por este compuesto (Boker, 2002).

• Safranina: La safranina actúa como el colorante secundario y es de carácter biológico cargado positivamente (catión), siendo capaz de combinarse con elementos celulares de cargas negativas, por lo que las bacterias Gram negativas se tiñen de color rojo. Sin embargo, las bacterias Gram positivas no se tiñen debido a que su pared celular está saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina. Después de la aplicación del alcohol-cetona, en la lámina donde se encontraban las tres muestras juntas, algunas células se mantienen teñidas y otras no, para esto, las células decoloradas deben ser sometidas a una tinción de contraste para poder observarlas con la luz del microscopio; está “contratinción” está provista por este colorante safranina. Las bacterias grampositivas se permanecen con el color azul-violáceas mientras que las gram negativas se tiñen de rojo por la tinción de contraste con la safranina (Koneman, 2008). El teñido de la célula gram negativa puede ser interferida por los posibles restos del decolorante que aún permanezcan en la célula, por lo cual se espera un tiempo de dos minutos para que el colorante tiñe sin problemas la célula, una vez el colorante esté fijado no hay peligro de que se pierda en el lavado; sin embargo, a veces las bacterias gram positivas en fase estacionaria pueden aparecer como gram negativas debido al proceso de degradación y autolisis de la capa de peptidoglicano.

Diferencias entre Gram Positivas y Negativas

Esquema 2.: Diferencias entre células bacterianas Gram positivas y Gram negativas

...