Cinetica De Crecimiento De Saccharomyces Cerevisiae Por Lote, Continuo Y Lote Alimentado

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE VERACRUZ

INTRODUCCIÓN.

La fermentación es un proceso biológico, originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por general azúcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, etc.) para obtener como productos finales como un alcohol en forma de etanol.

La siguiente practica desarrolla la cinética de crecimiento del microrganismo Saccharomycescerevisae, el cual se desarrolla en un cultivo por lote,continuo y lote alimentado.

Primeramente se lleva acabo la esterilización de los instrumentos a utilizar, la preparación del medio de cultivo y la inoculación de la cepa.

Se carga el reactor con 1.5 litros de medio, se establece un cultivo por lote estableciendo las condiciones ambientales y nutricionales que requiere la cepa.La cinética se monitorio por 8 horas, analizando cada 2 horas el pH, la densidad óptica, el conteo celular y el HPLC.

Posteriormente se inicio conecto al reactor una alimentación del medio y un flujo de salida, empezando así el cultivo continuo, desarrollando la cinética por 10 horas analizando las muestras cada 2 horas.

Una vez transcurridas las 10 horas de cultivo continuo se cerro el flujo de salida, dejando únicamente el flujo de alimentación, estableciendo asi el cultivo por lote alimentado, el cual se monitorio por 10 horas, analizando las primeras 4 muestras cada media hora, y posteriormente cada 2 horas.

Con los resultados obtenidos se desarrolla también el calculo de :

METODOLOGIA

Para la activación de la levadura se llevó a cabo la preparación del medio. El medio que se utilizó fue Sacarosa. Se prepararon 75 ml de medio (50 ml de sales y 25ml de glucosa) .Las concentraciones requeridas de los reactivos fueron las siguientes:

Sacarosa : 100g/l

Extracto de levadura: 1 g/l

Urea: 3g/l

Fosfato monobásico de potasio: 5 g/l

Sulfato de magnesio 7H2O: 0.4 g/l

Por lo tanto se pesaron en la báscula analítica aeADAM PGW 153i las cantidades necesarias de acuerdo al volumen preparado, en pequeñas charolas de papel aluminio, con excepción del extracto de levadura que se pesó en una caja petri:

sacarosa =(100 g)/(1000 ml)×50 ml= 5g

Extracto de Levadura=(1 g)/(1000 ml)×25 ml=0.025 g

Sulfato de Amonio=(2 g)/(1000 ml)×25 ml=0.050 g

Fosfato monobásico de potasio=(5 g)/(1000 m)×25 ml=0.125 g

Sulfato de magnesio=(0.4 g)/(1000 ml)×25 ml=0.010 g

Fig. 1 Bascula Analítica ae ADAM PGW 153i utilizada

Conforme los reactivos se fueron pesando, se agregaron a un vaso de precipitado de 500 ml con agua destilada, sobre un agitador magnético PMC para disolverlos.

Fig. 2 Agitador magnético PMC

Posteriormente, se realizó el ajuste de pH en un pH-metro HANNA INSTRUMENTS mediante la adición de NaOH 4M o H3PO4 al 3%, según se requirió. el pH ajustado fue de 5.5.

Fig. 3 pH-metro HANNA INSTRUMENTS utilizado

Se procedió a distribuir el contenido en los matraces volumétricos para su aforo con agua destilada.

Una vez realizado el aforo, se vació el medio en un vaso de precipitado de plástico para su correcta homogeneización.

Los matraces con el medio de cultivo, fueron esterilizados en un autoclave Felisa, durante 15 minutos a 121° C y 15 lb/in2. Transcurrido el tiempo de esterilización, se retiraron los matraces del autoclave y se esperó a que enfriaran.

Se inoculó el medio de cultivo para la activación de la levadura, es decir, el medio correspondiente al matraz Erlenmeyer de 25 ml, con 3 azadas de la cepa de levadura Saccharomycescerevisiae ITV01 DR, cubriendo con un tapón de algodón; lo anterior se llevó a cabo en una campana de flujo laminar, previamente limpia y expuesta a luz U.V.

Fig. 4 Campana de flujo laminar

Posteriormente, se incubó durante 12 horas a 250 rpm, 30° C, en la incubadora

LabTech.

Fig. 5 Incubadora LabTech

Después de la activación, transcurridas las 12 horas, se tomaron 20 ml del cultivo con una pipeta previamente esterilizada y se transfirieron a los matraces correspondientes de 300ml en los cuales 200ml fueron sales y 100ml sacarosa, para llevarse a cabo el pre inoculo. Las concentraciones requeridas de los reactivos fueron las siguientes:

Pre inoculo

C1V1=C2V2

C1 (0.1l)= 100g/l (0.3l)

C1=(100g/l(0.3l))/0.1l= 30g: sacarosa en 100ml

Extracto de Levadura=(1 g)/(1000 ml)×200 ml=0.2 g

Fosfato monobásico de potasio=(5 g)/(1000 m)×200 ml=1 g

Sulfato de magnesio=(0.4 g)/(1000 ml)×200 ml=0.08 g

urea =(3 g)/(1000 ml)×200ml=0.6 g

De igual forma se cubrió con un tapón de algodón, lo anterior se llevo a cabo en una campana de flujo laminar, previamente limpia .

Posteriormente, se incubó durante 12 horas a 250 rpm, 30° C, en la incubadora LabTech.

Mientras tanto se realizo la esterilización del medio para introducirlo al reactor. Se prepararon 1.5litros de medio donde 0.5l fueron sales y 1l fue de sacarosa para después introducir las sales al reactor y este someterlo a esterilizar en el autoclave. La solución de sacarosa se introdujo en un matraz Erlenmeyer y de igual manera se metió a esterilizar al autoclave. Las sales se introdujeron al reactor y la sacarosa por separado para evitar la reacción de maillard.

El reactor para someterlo a la esterilización se le cubrieron las entradas y salidas del medio con papel aluminio, al igual que el motor y las mangueras también se sellaron.

Ya esterilizado el reactor se dejo enfriar y luego pasamos a realizar la conexión de las mangueras para la alimentación y salida del medio, al igual que se le instalaron las condiciones óptimas para el crecimiento de la levadura y esta pudiera producir etanol. Las condiciones que se le implementaron al reactor fueron los sensores reguladores de temperatura, agitación y flujo de aire. Para el control de la temperatura utilizamos una chaqueta.

Una vez instalado el reactor en el tanque de alimentación se le implementaron las soluciones salinas al igual que la solución de sacarosa, se tomo una muestra que se

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