CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

PREINFORME N° 02

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

OBJETIVOS:

OBJETIVOS GENERALES

Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado (CLA) con alimentación constante utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Diseño del medio de cultivo.

Activación celular y desarrollo del inóculo.

Identificar y describir las partes, accesorios y geometría, conocimiento de la operación del fermentador, esterilización, carga, descarga y toma de muestras.

Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automatico, asi como la calibración de los sensores.

Puesta en marcha del CLA. En el cultivo por lote determinar µmax y Yx/s

Obtener los perfiles de masa celular, fuente de C y O2 disuelto a través del tiempo total de fermentación en el bioreactor.

Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

Determinar Yx/s y Qx del CLA.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL:

Empleando la técnica de batch alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo.

El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.

ESQUEMA

Donde F(t): caudal de alimentación

Sr(t):concentración de sustrato de la alimentación

Vf: volumen final de trabajo

Vo: volumen al inicio de la alimentación

Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación

So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que Vo, Xo y So son las condiciones finales de dicho batch.

Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la concentración de sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se utilizará el sistema más simple, es decir F=cte y Sr=cte.

Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t), dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

Para diseñar el medio de cultivo se realizará de acuerdo a los alcances que nos proporciona la guía de práctica, en el cual podemos conocer los requerimientos del microorganismo, para su mantención, activación y para la fermentación del cultivo por lote alimentado.

El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas.

Para el diseño se debe considerar:

Usar Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11).

Duración aproximada de 4 a 6 horas de la etapa de CLA.

Usar el bioreactor automatizado Biostat – A Plus recipiente de 2 litros.

Control de pH usando electrodo y unidad de control.

La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

“COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 “

MEDIO SÓLIDO DE MANTENCIÓN (YM sólido)

TABLA 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (80 mL)

Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Para 80 mL

Extracto de Levadura 3 0.24

Peptona 5 0.4

Extracto de Malta 3 0.24

Agar 20 1.6

Glucosa 10 0.8

MEDIO DE ACTIVACIÓN

TABLA 02: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (100 mL)

Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Para 100 mL

Sacarosa 15 1.5

Extracto de levadura 3 0.3

Extracto de malta 5 0.5

Solución de sales 5 ml/L 0.500

T 35°C, N 200 rpm

MEDIO DE FERMENTACIÓN

TABLA 03, 04 y 05: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación

TABLA 03

Nutriente Concentración (g/l)

Sacarosa

Extracto de Levadura 1.8

(NH4)2SO4

KH2PO4

MgSO4 7H2O

Solución de sales 10ml/L

pH 4.2

TABLA 04 - Concentración de Nutrientes para el medio de Fermentación

Elemento Nutriente % en Célula % en nutriente Y x/s (g/g) S0 (g/l) S’0 (g/l)

C Sacarosa (C12H22O11) 45 42,105 0,5614 3,2062 3,2062

N Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 9 21,21 2,3567 0.7638 1.1457

Mg Sulfato de Magnesio Heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0,4 9,86 24,65 0.0730 0.1095

S Sulfato de Magnesio Heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0,25 12.99 51.96 0.0346 0.0519

K Fosfato Potásico (KH2PO4) 0,5 28.67 57.34 0.0314 0.0470

P Fosfato Potásico (KH2PO4) 2,0 22.79 11.395 0.1579 0.2369

Limitante: Fuente Carbono

TABLA 05 – Para el medio de Fermentación por Lote 1000 mL

Nutriente Fuente Concentración (g/l) Peso (g)

Para 1000 mL

C12H22O11 C 3,2062 3,2062 g

Extracto de Levadura - 1.8 1.8 g

(NH4)2SO4 N y S 1.1457 1.1457 g

KH2PO4 K y P 0.2369 0.2369 g

MgSO4.7H2O Mg y S 0.1095 0.1095

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