Cinetica de la glucosa

¿Cinética de la glucosa oxidasa inmovilizada en microesferas de hidrogel p (HEMA) en un biorreactor de lecho empaquetado

Abstracto

La glucosa oxidasa (GOx) se inmovilizó a través de atrapamiento físico y enlace covalente a metacrilato de poli (hidroxietil metacrilato-co-dimetilaminoetilo), (p (HEMA-DMEMA)) microesferas de hidrogel (20-150 m de diámetro) que se sintetizaron por suspensión inversa polimerización. Las capacidades de carga de 7-8 mg de GOx por gramo de hidrogel se lograron con atrapamiento físico, comparado con <1,8 mg de GOx por gramo de gel con la técnica covalente. Las microesferas que contenían la enzima atrapada físicamente se empaquetaron en biorreactores y la cinética de La dependencia del caudal de Km (app) y Cmax, cuando se extrapoló a condiciones casi libres de difusión, resultó en valores de 13,2 mM y 2,7 ​​× 10-3 mol min-1, respectivamente, para la enzima inmovilizada. Los estudios de la dependencia del pH de Km (app) y Cmax sugieren que los grupos imidazolio y sulfhidrilo pueden estar implicados en el sitio activo del GOx inmovilizado. la dependencia de la temperatura de C y Cmax confirma energías de activación inferiores para la oxidación de la glucosa a temperaturas> 35 ° C, lo que sugiere la influencia de las limitaciones de difusión dentro del hidrogel. © 2002 Elsevier Science B.V.

Introducción

La condición de las enzimas y su capacidad para catalizar las reacciones las hacen atractivas para aplicaciones en campos bioquímicos, biomédicos, industriales y bioanalíticos. Una ventaja importante de condición es que los rendimientos están libres de productos secundarios. Sin embargo, la recuperación y la reutilización de enzimas libres como catalizadores son bastante limitadas y esto ha llevado al desarrollo de una amplia variedad de técnicas de inmovilización. La inmovilización también ofrece otras ventajas tales como la elección de procesos discontinuos o continuos, la terminación rápida de las reacciones, la formación de productos controlados, la facilidad de eliminación de la mezcla de reacción y la adaptabilidad a diversos diseños de ingeniería [1 - 3]. Entre los métodos disponibles para la inmovilización enzimática, el atrapamiento de la matriz parece tener ventajas sobre los demás, como la simplicidad del proceso de inmovilización y el hecho de que la enzima se mantiene en su estado nativo. Con esta técnica, no se utiliza ningún grupo reactivo de ningún resto de aminoácido de la proteína para formar enlaces covalentes específicos con la matriz con el fin de lograr la inmovilización enzimática [4]. Actualmente, existe un interés considerable en la preparación, propiedades y el uso de sistemas enzimáticos soportados sólidos debido a sus posibles aplicaciones en tales como los análisis automatizados [5 - 7], las investigaciones clínicas [8], síntesis en disolventes orgánicos [9, 10] y como la capa de reconocimiento en biotransductores como parte de biosensores [11, 12]. Además, estos sistemas de enzimas sólido-apoyados pueden servir como sistemas modelo para el comportamiento de las enzimas in vivo [13]. Los geles de poliacrilamida se han empleado ampliamente como el material de matriz de elección para inmovilizaciones enzimáticas por encaje. Sin embargo, la resistencia mecánica de estos geles es baja y hay informes frecuentes en la literatura de la fuga de enzimas de estos geles. El uso de poli (hidroxietil metacrilato) (pHEMA) como una matriz para la inmovilización de las enzimas se informó por primera vez a principios de 1980 [14, 15]. Desde entonces, los informes utilizando p (HEMA) como la matriz para la captura y la inmovilización de la glucosa oxidasa (GOx) han sido todos destinados a la producción de glucosa-sensible a las membranas [16, 17], sin mucha consideración detallada y la discusión de la influencia de la matriz sobre la cinética de la enzima inmovilizada. En este manuscrito, presentamos una idea del papel de esta matriz hidrogel sensible al pH en la influencia del mecanismo de acción de la enzima inmovilizada. El presente estudio se refiere a la preparación y caracterización de microesferas de pHema como matriz de inmovilización para GOx. Las microesferas se hicieron sensibles al pH por copolimerización de metacrilato de dimetilaminoetilo (DMEMA) dentro de la red de hidrogeles p (HEMA). La dependencia del pH y la temperatura de la cinética enzimática inmovilizada se estudiaron bajo condiciones de flujo en un biorreactor de lecho empaquetado. Los resultados se analizaron en términos de las ecuaciones cinéticas desarrolladas por Lilly et al. [18] para sistemas de flujo de enchufe en biorreactores de lecho empacado.

material y métodos

2.1. Productos químicos Se obtuvieron

GOx (E.C. 1.1.3.4 de Aspergillus niger, 152.000 unidades de sólido g-1),

sesquioleato de sorbitán y aceite mineral blanco claro de Sigma (St. Louis, MO).

El monómero, metacrilato de hidroxietilo (HEMA) se obtuvo de Polysciences Inc. (Warrington, PA), mientras que el monómero de metilformacetilato de dimetilaminoetilo (DMEMA), el reticulante tetraetil- diacrilato de leneglicol (TEGDA) y las columnas removedoras de inhibidores (número de catálogo 30.631-2) se adquirieron de Aldrich (Milwaukee, WI). Estas columnas se usaron para eliminar el inhalador de hidroquinona de monometil éter que se usa como conservante para evitar que los monómeros de metacrilato se polimericen durante el almacenamiento. El monómero HEMA se destiló al vacío (1,3 mm Hg, 80 ◦ C) antes de su uso. Todos los demás reactivos utilizados eran del grado de reactivo analıtico y se obtuvieron de BDH (Poole, UK).

3. Métodos

3.1. Método general para la preparación de microesferas de hidrogel por polimerización en suspensión inversa La polimerización en suspensión inversa da lugar a partículas esféricas casi perfectas que, cuando se envasan en biorreactores de columna, permiten realizar trabajos con caudales elevados con una pérdida de presión mínima. El procedimiento detallado para la síntesis de miocrosferas de hidrogel se describe en trabajos anteriores [19]. En resumen, se disolvieron los volúmenes apropiados de HEMA (H), DMEMA (D) y TEGDA (T) que estaban todos previamente des-inhibidos se disolvieron en una alícuota del buffer (fosfato / citrato, 25 mM cada uno, pH 6,8) - producir una relación de monómero: acuoso de 1: 1 (fase discontinua). La fase continua consistía en sesquioleato de sorbitán (2,50 ml) disuelto en aceite de parafina (50,0 ml). Las fases continua y discontinua se purgaron con nitrógeno durante 30 min. La solución de monómero purgada, a la que se añadió el iniciador redox peroxidisulfato de amonio (APS, 0,140 g disuelto en 0,50 ml del buffer), se vertió luego se vertió en el matraz de polimerización que contenía la fase continua. Esta mezcla se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno a 15 ◦ C y con una velocidad de agitación de 1500 rpm usando un agitador de paletas. El proceso de polimerización se inició inyectando N, N, N, N-tetrametiletilendiamina (TEMED, 0,50 ml) en la mezcla de reacción y se dejó continuar la polimerización durante 10 min. Las microesferas de hidrogel polidispersas producidas se centrifugaron (1200xg, 1 min) y después se lavaron con acetona seguido de tampón fosfato / citrato (buffer de trabajo). Finalmente, las microesferas se tamizaron secuencialmente en húmedo con mallas de 150 y 20 m. Estas dimensiones correspondían a la parte superior e inferior diámetros de las microesferas que se usaron en el biorreactor, respectivamente. Las microesferas se almacenaron entonces en el tampón de trabajo a 4◦C.

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