Cuadernillo De Practicas De Metabolismo

Practica 1: Química sanguínea

Glucosa Liquicolor

Resumen y principio

La metodología de la glucosa- oxidasa fue introducida por Keilin y Hartree en 1948. Más tarde Keston reporto el uso de un reactivo combinando glucosaoxidasa- peroxidasa, seguido por el de Teller adicionando un rwactivo cromogenico al procedimiento de Keston. En particular, el método del reactivo de glucosa stanbio esta basado en la técnica descrita por Trinder et al.

La glucosa es oxidada en presencia de glucosa oxidasa (GOD). El peróxido de hidrogeno formado, reacciona bajo la influencia de peroxidasa (POD) con fenol y 4- aminoantipatrinapara formar un complejo rojo-violeta de quinona. La intensidad del color es proporcional a la reacción de la glucosa

Reactivos

Glucosa liquicolor

Estándar de glucosa

Materiales

Espectrofotómetro a 540 nm

Pipetas automáticas

Bloque de calor o baño a 310 K (37° C)

Cubetas

Agitador

Cronometro

Recolección y preparación de la muestra

Suero: remover el coagulo antes de 30 min de su recolección para prevenir la glucolisis

Plasma: se recomienda utilizar un anticoagulante que no contenga flúor, sin embargo se puede utilizar otro anticoagulante común. Centrifugue y separe el plasma rápidamente de las células.

Procedimiento manual

Coloque en cubetas los siguientes volúmenes (ml) y mezcle bien

Reactivo

Blanco (RB) Estándar

(E) Muestra

(M)

Reactivo 1.0 1.0 1.0

Estándar 0.1

Muestra 0.1

Nota: se usaran los volumes al doble

Incube las cubetas a 310 K (37°C) por 5 min a temperatura ambiente 288- 303 K (15- 30°C) por 10 min.

Lea E y M contra RB a 500 nm antes de 60 min.

Resultados

Los valores se derivan de la siguiente ecuación:

Glucosa (mg/dl) =AM/AE X 100

Donde AM y AE son los valores de las absorbancias de la muestra y el estándar respectivamente, y 100 es la concentración del estándar (mg/dl).

Valores esperados

Rango normal: suero/plasma 70- 105 mg/dl

Resultados obtenidos

AM= 0.200

AE= 0.240

Glucosa= 0.200/0.240 x 100 =

Acido Urico

Resumen y principio

La uricasa actua sobre el acido urico para formar peróxido de hidrogeno y alantoina. El H₂O₂ es leído cuantitativamente por su reacción con el acido 3,5- dicloro-2 –hidroxibenzosulfonico (DCHB) en presencia de peroxidasa y 4- aminofenazona, para formar un complejo quinoneima de color rojo violeta.

Acido urico + H₂O H + CO₂ + alantoina

H₂O₂ + DCHB + 4 aminotranferasa

Reactivos

Acido urico enzimático

Estándar de acido urico enzimático

Materiales

Espectofotometro a 540 nm

Cubetas

Tubos de ensaye

Bloque de calor/ baño a 310K (37°C)

Pipetas serológicas o automáticas

Mezclador vortex

Cronometro

Recolección y preparación de la muestra.

Se recomienda usar suero o plasma con heparina o EDTA. Evite la hemolisis.

Procedimiento manual

Pipetear en las cubetas los siguientes volúmenes (ml) y mezcle bien

Reactivo

Blanco (RB) Estándar

(E) Muestra

(M)

Reactivo 1.0 1.0 1.0

Estándar 0.02

Muestra 0.02

Nota: se usaran los volúmenes al doble

Incube todas las cubetas a 310K (37°C) por 5 min y deje enfriar o incube a temperatura ambiente por 15 min.

Lea E y M contra RB a 520 nm antes de 15 min.

Resultados

Calcule los resultados utilizando la siguiente ecuación

Ácido úrico en suero o plasma (mg/dl) = A_M/A_E x8

Valores esperados

Hombres: 3.4- 7.0 mg/dl

Mujeres: 2.4- 5.7 mg/ dl

Resultados obtenidos

AM= 0.027

AE= 0.105

Ácido úrico=0.027/0.105 x 8=

Nitrogeno de Urea (BUN)

Principio y resumen

La urea es el principal producto de deshecho del catabolismo de proteínas. Es sintetizada en el hígado a partir del amonio, el cual es producido como resultado de la desaminacion de aminoácidos. Normalmente, el nitrógeno de urea en la sangre comprende solo el 45% del nitrógeno no proteico. La importancia de la determinación del nitrógeno de urea es su valor como buen indicador del funcionamiento hepático y renal. La disminución de los niveles de nitrógeno de urea (BUN) se ha visto en la nefritis, destrucción hepática aguda, amiloidosis y embarazo. Valores elevados de BUN se han visto en casos de nefritis aguda y crónica, obstrucción urinaria e intestinal, uremia, envenenamiento por metales, neumonía, enfermedad de Addison, peritonitis, shock en cirugía y fallas cardiacas.

El procedimiento de BUN stanbio es una modificación del método descrito por Sampson. La urea se convierte catalíticamente a carbonato de amonio por acción de la ureasa. La velocidad de reacción depende de la concentración de deshidrogenosa glutámica. La velocidad de acción de esta segunda reacción es dependiente de la primera y puede medirse por la velocidad de conversión de NADH a NAD por el cambio de absorbancia a 340 nm.

Reactivos

Regulador de BUN (R1)

Enzima de BUN (R2)

Estandar de BUN

Preparación del reactivo

El buffer y los reactivos de enzimáticos liquidos están listos para su uso.

Prepare el reactivo de trabajo en una proporción de 5 partes de buffer (R1) y 1 parte de enzima (R2); (por ejemplo 25ml de buffer y 5ml de la enzima).

Materiales

Espectofotometro a 340 nm

Baño a temperatura constante 310K (37°C)

Pipetas serológicas y automáticas

Tubo de ensaye

Cronometro

Recolección y almacenamiento de la muestra

El suero no hemolizado es la muestra de elección.

Procedimiento

Prepare el reactivo de trabajo BUN de acuerdo al instructivo

Calibre a cero el espectofotometro a 340 nm con agua destilada

Por cada muestra y control, agregar 1.0 ml de reactivo de trabajo a la cubeta o al tubo de prueba y llevar a 310K (37°C) por 3 min

Adicionar 10 µL (0.010 ml) de suero a cada tubo respectivamente y agitar levemente

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