Cuantificación de RNA y DNA

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Nombres: Cinthya Jiménez, Adrián Proaño, Zaskya Valencia

Materia: Biología Molecular I                

Practica N°: 3                    Fecha: 29/07/2016                Curso/NRC: 2427

1. TEMA

Cuantificación de RNA y DNA

1. OBJETIVOS

• Emplear la técnica de y/o procedimiento de cuantificación de DNA y RNA de una manera adecuada para obtener los resultados correctos.
• Calcular las absorbancias a 260 nm y 280 nm de nuestras muestras de ADN utilizando el espectrofotómetro del laboratorio de docencia.
• Cuantificar  la pureza de la extracción de ADN realizado en la práctica N°2 (Extracción de DNA).
• Manejar adecamente los reactivos de acuerdo a su función en el procedimiento de cuantificación de DNA y RNA de tejidos vegetales.

1. MARCO TEÓRICO

Una vez obtenido tanto el ADN como el ARN se procede a evaluar su cantidad como su calidad, para realizar este procedimiento la técnica más utilizada es la Espectrofotometría. La espectrofotometría es usada para identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de un material o sustancia, lo que permite conocer la concentración de compuestos, seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas así como determinar enzimas y proteínas incluso ácidos nucleicos. La espectrofotometría UV/Visible permite la confirmación de la existencia de cantidad suficiente de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de calidad adecuada antes de llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR), análisis de SNPS (Polimorfismos de nucleótido único) o la secuenciación automática de muestras de DNA de plásmidos, cósmidos, productos de PCR, etc., las ventajas sobre otros métodos de laboratorio son que es rápido, versátil y fácil de usar. (Biología Molecular)

El DNA, el RNA, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos se pueden cuantificar en un proceso en el cual se utiliza directamente soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, con las que se mide la absorbancia de la luz ultravioleta (Traverso Gutiérrez, 2005). Las bases púricas y pirimidínicas del ADN poseen la propiedad de absorver la lus ultravioleta a una longitud de onda especifica (Zimmermann, Luthy, & Pauli, 1998). Es importante conocer que, debido al emparejamiento de las bases, los puentes de hidrogeno, el ADN bicatenario absorbe menos luz que el monocatenario (Andina, 2015).

Si la muestra no contiene cantidades grandes de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, podemos decir que esta es pura por lo tanto la medición mediante el espectrofotómetro de la irradiación ultravioleta por las bases es sencilla y muy exacta.  (Somma, 2007)

La concentración de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) se determinan midiendo a 260 nm con la comparación de un blanco (González, 2006). Al conocer que puede existir cierto porcentaje de contaminación, esta interface se la puede determinar mediante un cociente (Hotzel, Muller, & Sach, 2009).

Dado que las proteínas pueden absorver a 280nm, es necesario el cociente A260/A280 con el que se calcula la pureza que presenta la extaraccion de los acidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Si estos valores se encuentran bajo el rango mencionado anteriormente, nos proporciona la información de que la muestra puede poseer contaminación procedente de las proteínas propias de la muestra (Hotzel, Muller, & Sach, 2009).

Si se obtienen estos resultados se procede a la purificación de la muestra para obtener un valor real de la concentración de los ácidos nucleicos, existen varios métodos, como el lavado con etanol, el cual puede eliminar las moléculas que no sean nucleótidos (Traverso Gutiérrez, 2005).

1. MATERIALES Y MÉTODOS:

1. PROCEDIMIENTO

1. Se realizó una previa extracción de ácidos nucleicos que contenga aproximadamente 10 a 30 ul de muestra.

2. Encendimos el espectrofotómetro 15 minutos antes de usarlo.

3. Enceramos el aparato usando el blanco.

4. Si la muestra es muy concentrada se debe realizar una dilución 1 en 500 o 1 en 1000 en agua destilada.

5. Se realizó una primera lectura a 260nm.

6. Se realizó una segunda lectura a 280nm.

7. Se realizó el cálculo según la dilución y los radios para conocer la cantidad de ácidos nucleicos presentes en la muestra.

1. RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Tabla 1: Tabla de Absorbancia de las muestras

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