Cuantificacion De Proteinas

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS, MÉTODO DE BIURET.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas (Berg et al, 2008).

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes (Segal, 2005).

La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de un enlace peptidico, como las proteinas (Cambell et al, 2006):

Figura 1: Reacción de Biuret.

La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva patrón, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración (Harris, 2003)

OBJETIVO GENERAL

Aplicar un método colorimétrico para determinar la concentración de proteína en una muestra problema.

OBJETIVOS PARTICULARES

Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación en los métodos colorimétricos.

Aprender el empleo de una curva patrón para la determinación de la cantidad de moléculas presentes en una muestra, en este caso de proteínas.

Determinar la concentración de proteínas en una muestra de leche, utilizando el método de Biuret.

HIPÓTESIS

Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada con el reactivo de Biuret ésta será proporcional a la concentración de proteína de dicha muestra.

MATERIAL Y MÉTODO

Primero, se dispuso a tomar la caseína y macerar con ayuda de un mortero con pistilo, después se peso para ocupar 0.1g para una solución de 1:10, al no disolverse bien se le agregaron gotas de hidróxido de sodio hasta llegar a la homogenación deseada, también se realizo la solución de leche 0.05ml para una solución 1:20 y se disolvieron en agua; Al mismo tiempo se calentaba agua hasta llegar a una temperatura de 500C a 550C.

A continuación, se separaron 24 tubos de ensaye en dos grupos de 12 “A y B” los seis primeros se utilizaron para obtener la curva patrón y los otros seis para obtener la curva problema esto en los dos grupos, el tubo 1 se ocupó como blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al 5 0.8ml, al 6 1.0ml de albumina sérica bovina (BSA) con concentración de 10 mg/ml, respectivamente.

En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de caseína, el 9 con 0.25ml y el 10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con 0.25 ml y el 12 con 0.5ml de leche diluida, (todo esto obtenido en la práctica anterior); a todos los tubos se les agrego Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente cantidad de 2.9ml al 2, 2.8ml al 3, 2.6ml al 4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6. Para tener una solución de 3ml y reactivo de Biuret con la misma cantidad de 3 ml, así logramos una solución de 6ml, se homogenizo la solución por medio de un agitado tipo vortex. (Solamente al tubo 1 se le agregaron 3 ml de reactivo de biuret y 3 ml de NaCl)

Después de tener todos los tubos con la solución se colocaron en un vaso de precipitados de 1000 ml con agua caliente y se dejaron durante 10 minutos aproximadamente (hasta lograr tonalidades de azul cielo a violeta), al termino del tiempo se colocaron en agua a temperatura ambiente, hasta lograr que se enfriara la solución.

Posteriormente se realizo la cuantificación de la solución por medio de un espectrofotómetro a 540 nm de los tubos A y B, entre cada medición se lavaban las celdas; al tener todas las mediciones se dispuso a realizar la curva obtenida.

RESULTADOS

Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotómetro a 540 nm para cada una de las 12 soluciones se muestran a continuación (solamente se muestran los tubos A y no los duplicados):

Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.

Tubo No. Solución * Proteína (mg) Absorbancia

a 540 nm

1 3 ml NaCl, 0 Blanco

2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 0.034

3 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 0.071

4 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 0.142

5 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 0.277

6 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 0.345

7 0.25 ml caseína y 2.75 ml NaCl ¿? 0.079

8 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl ¿? 0.198

9 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl ¿? 0.221

10 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl ¿? 0.240

11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl ¿? 0.044

12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl ¿? 0.068

*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.

Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se realizó la gráfica 1, de la curva patrón de proteína, obtenida por el método de regresión lineal de mínimos cuadrados; donde las abscisas (x) representan la concentración en mg de proteína, y las ordenadas (y) los valores de la absorbancia de cada concentración.

Figura 2: Curva patrón de proteína.

La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema, tubos siete a doce, se obtuvo con el valor de la absorbancia obtenida por el espectrofotómetro para cada muestra (tabla 1), mediante la interpolación de estos valores en la curva patrón (figura 3) y despejado los valores respectivos de x de la ecuación de la recta (y= mx + b) tal como

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