Cuantificacion De Proteinas

Introducción

William Prout en 1827 clasificó unas sustancias dándole el nombre de "albuminosas" a lo que hoy conocemos como proteínas. Por otro lado Gerardus Johannes Mulder (1802-1880), un químico Holandés que en 1838 descubrió las misma sustancias provenientes de aminoácidos que conformaban la materia básica de animales y plantas, llamándolas proteínas. Hoy en día se puede afirmar que las proteínas son macromoléculas compuestas básicamente por unidades llamadas aminoácidos. La palabra proteína proviene del griego “proteios”, primario, término ideado por un químico llamado Berzelius (1779-1848).

Hay 20 tipos de aminoácidos que se combinan para formar las proteínas y dependiendo de cómo estos aminoácidos se combinen, se determinará la función de la proteína (1). Para determinarlas se pueden utilizar métodos como la Ley de Lambert–Beer, que relaciona la propiedad de las proteínas para absorber la luz UV con un intervalo de longitud de onda entre 230-300 nm. Otra forma es utilizando el reactivo de Biuret, un método colorimétrico a una longitud de onda de 540 nm para detectar los iones cu2+, este reactivo es azul y cambia de color en presencia de proteínas a violeta o a un color rosa si la proteína tiene una cadena corta de polipétidos. Ambos métodos se realizan con la ayuda de un espectrofotómetro.

Objetivos del práctico

• Conocer el uso y función de un espectrofotómetro, para luego determinar concentraciones y cuantificaciones de proteínas usando el método de la Ley de Lambert-Beer y usando el reactivo de biuret.

Procedimiento experimental

Se comenzó el práctico rotulando 3 tubos de ensayo agregando con la micropipeta p1000 3 mL de NaCl al tubo 1, 3 mL de SAB (seroalbúmina de bovino) 1 mg/ml al tubo 2 y 3 mL de OVA (ovoalbúmina) 1:200 al tubo 3, luego cada muestra se colocó en una cubeta de cuarzo para después posicionarlas en el espectrofotómetro usando una longitud de onda de 280 nm y también usando la muestra de NaCl como blanco espectrofotométrico y determinar la absorbancia.

En la segunda parte del práctico se rotularon 8 tubos de ensayo, para luego agregar a los primeros 6 tubos NaCl 0,9% y SAB 5 mg/ml usando la micropipeta p1000; al tubo 1 se vertió 2,0 mL de NaCl, al tubo 2 se vertió 1,8 mL de NaCl y 0,2 mL de SAB, al tubo 3 se vertió 1,5 mL de NaCl y 0,5 mL de SAB, al tubo 4 se vertió 1 mL de NaCl y 1 mL de SAB, al tubo 5 se vertió 0,5 mL de NaCl y 1,5 mL de SAB y al tubo 6 se vertió 2,0 mL de SAB. Al tubo n°7 se le agregó directamente 2,0 mL de OVA 1:80 y al tubo n°8 2,0 mL de orina 1:10. Finalmente a cada uno de los 8 tubos se añaden 2,0 mL del reactivo de Biuret, dejando temperatura ambiente incubar durante 5 minutos.

Para determinar la absorbancia de las soluciones los 8 tubos de ensayo, se transfirió cada solución a cubetas de plástico para después ponerlas en el espectrofotómetro usando una longitud de onda a 545 nm utilizando la muestra de NaCl como blanco espectrofotométrico.

Resultados

1. Reconocimiento y cuantificación de proteínas por absorbancia a 280 nm.

• En base a los datos de la tabla n°1 (anexo n°1) se obtuvieron las siguientes absorbancias: el tubo 1 es el blanco espectrofotométrico, el tubo 2 arrojó una absorbancia de 0,605 de SAB y el tubo 3 arrojó una abosorbancia de 0,512 de OVA.

2. Reconocimiento y cuantificación de por absorbancia a 545 nm (Ractivo de Biuret).

• En base a los datos de la tabla n° 2 (anexo n°3) se obtuvieron las siguientes absorbancias: el tubo 1 es el blanco espectrofotómetro, el tubo 2 arrojó una absorbancia de 0,056; el tubo 3 arrojó una absorbancia de 0,141; el tubo 4 arrojó una absorbancia de 0,324; el tubo 5 arrojó una absorbancia

...