Cuantificacion De Proteinas

I. Introducción:

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas. (Berg et al, 2008).

Por tanto, especificar la concentración de tales polímeros en una muestra biológica es una técnica de rutina básica en un laboratorio de bioquímica, cuando se lleva a cabo la purificación de una proteína en particular, cuando se quiere conocer la actividad enzimática de una preparación enzimática, para el diagnostico de enfermedades, como para otros propósitos.

Existen diversas técnicas para determinar la concentración de las proteínas, varias de ellas se basan en la capacidad propia de cada una para absorber la luz UV, unirse a ciertos colorantes o su capacidad para formar determinados derivados químicos. (Segal, 2005).

Todas las proteínas absorben luz ultravioleta fuertemente bajo los 230 nm debido a su enlace peptidico, sin embargo otros compuestos como los buffers también absorben esta longitud de onda, interfiriendo la determinación de la concentración de proteína. Sin embargo, existen tres aminoácidos, tirosina, triptófano y fenilalanina, que absorben luz ultravioleta en una región cercana a la visible del espectro electromagnético (280nm). Dado que la mayoría de las proteínas contienen estos residuos aromáticos, constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteína de una solución.

El método más accesible y económico para la docencia es el método de Bradford que se basa en la cuantificación de la unión del colorante azul brillante coomassie a una proteína desconocida y a la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar. Es un método mucho más sensible que el del Biuret, ya que no requiere preparados muy concentrados.

II Objetivo:

Aplicar el método de Bradford para determinar la concentración de proteína en una muestra problema, a través de una curva estándar.

III. Método:

El método utilizado fue el de Bradford .

En una gradilla con 6 tubos de Eppendorf, con sus respetivos duplicados (12 tubos para obtener resultados mas exacto en la curva Standard). Se rotulan los tubos desde 0 a 5 y de 0’ a 5’ (duplicados), siendo el 0 la muestra blanco (contienen agua como base para descontar sustancias ajenas a la muestra).

A cada tubo Eppendorf de la muestra, se le agrega los reactivos indicados en la tabla a. con la micropipeta correspondiente.

Los reactivos se fueron agregando en orden decreciente de acuerdo con su volumen, primero el reactivo Bradford, luego el agua y posteriormente la proteína estándar.

En dos tubos Eppendorf se le agrega la muestra problema, la proteína 50l

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