Cuantificacion De Proteina

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

CQU-310

Cuantificación de Proteínas

Integrantes: Rosa Maria Hidalgo Ultreras

Tanya Sarai Gonzalez Melgarejo

Sección: 405

Profesor(es): Francisco Vargas

Fecha: 10-04-2014

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son constituyentes esenciales de todos los organismos. La mayoría de las tareas que realizan las células requieren de proteínas. La diversidad de funciones que pueden realizar es asombrosa. Por ejemplo, en animales las proteínas son componentes estructurales principales del músculo, del tejido conjuntivo, las plumas, uñas y el pelo. Además de servir como material estructural en todos los seres vivos, las proteínas participan en funciones tan diversas como la regulación metabólica, el transporte, la defensa y catálisis (1).

Existen variados métodos para reconocer y cuantificar proteínas, uno de ellos es la colorimetría. La colorimetría es un método muy utilizado para el reconocimiento de proteínas, la cual determina a través de la capacidad de absorber longitudes de onda de luz incidente la presencia de proteínas en una solución. Siendo esta absorción proporcional al espesor del medio y la concentración de la sustancia presente (por lo tanto proporcional a su concentración molar). Este método se rige por la ley de Lambert-Beer: A=E *C*I. Siendo “A” absorbancia de la sustancia, “E” el coeficiente de extinción molar, “C” es concentración e “L” es el espesor.

La Ley de Lambert-Beer afirma que la materia absorbe luz y que la cantidad de luz que sale de nuestra muestra es afectada por tres fenómenos:

-La concentración de la sustancia

-La distancia que debe recorrer la luz a través de la muestra

-El tipo de sustancia por la que atravesará la luz

Una de las técnicas de las cuales se ha utilizado para la medición en base a la luz, es la Espectroscopía.

La espectrometría es la técnica utilizada por la física y química, para medir la concentración o cantidad de una determinada especie química (atómica, molecular o iónica). Mediante la absorción o emisión de radiación electromagnética a ciertas longitudes de onda.

El instrumento utilizado es el espectrofotómetro el que entrega información sobre la sustancia utilizada y nos indica indirectamente la sustancia que queremos analizar.

Para determinar la concentración de una sustancia espectrofotométricamente es necesario:

- Un blanco con todos los componentes exceptuando las sustancias a medir.

- Una serie estándar en donde se conozcan las concentraciones de todos los componentes.

- Una muestra problemas para poder determinar su concentración mediante el espectrofotómetro.

Existen cuatro diferentes métodos que permiten medir las concentraciones de proteínas con un cierto rango de exactitud y fiabilidad. Estos son:

Método de Lowry, el cual posee bastante sensibilidad, es colorimétrico y ayuda a cuantificar proteínas, este método consta de dos etapas:

1-Reaccion previa de la proteína en medio alcalino o iones Cu2+

2.-Reacción de reducción del reactivo Folin-ciocalteau.

Método de Biuret : método que demuestra ser bastante específico para el reconocimiento de proteínas.

Método de Bradford: método que tiene como ventaja ser muy sensible (al reconocimiento de las proteínas????) pero demuestra interferencia con los detergentes

BCA (Ácido Bicinconinico): método aún más sensible y que demuestra casi una nula interferencia.

OBJETIVOS

• Conocer métodos de reconocimiento y cuantificación de proteínas.

• Determinar espectrofotométricamente la concentración de Albúmina de suero bovino (BSA), utilizando el método de Lowry.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el procedimiento experimental, se utilizó los siguientes materiales:

- 7 Tubo de ensayos

- Pipeta graduada 1 ml y 5ml

- Vaso precipitado

- Baño termorregulador a 55 C°

- Volumen de BSA 0.4 mg/ ml (ml)

- Volumen de H2O (ml)

- Volumen de Reactivo de cobre alcalino (ml)

- Volumen de reactivo Folin (ml)

Materiales Capacidad de uso

Pipeta 1 Utilizada para agregar a los tubos BSA y Reactivo Cobre Alcalino

Pipeta 2 Utilizada para agregar a los tubos Reactivo Folín

Cubetas de espectrofotometría. Cantidad 7 de 1 cm cada una utilizadas para llevar nuestras muestras al espectrofotómetro.

Espectrofotómetro Identifica la longitud de onda, lo que visualmente no se ve.

Resumiendo su determinada preparación y concentración para cada tubo de ensayo, en la siguiente tabla:

N ° de Tubo Volumen de BSA O,4mg/ml (ml) Volumen de H2O (ml) Volumen de

R.C.A. (ml) Volumen de R.F. (ml)

0 Blanco --- 1,0 1,0 4,0

1 0,1 0,9 1,0 4,0

2 0,2 0,8 1,0 4,0

3 0,3 0,7 1,0 4,0

4 0,4 0,6 1,0 4,0

5 0,5 0,5 1,0 4,0

6 (Muestra problema) 0,5 0,5 1,0 4,0

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