Cuantificación de proteínas por el método de Lowry

Cuantificación de proteínas por el método de Lowry

Objetivo: El objetivo de la práctica es determinar la concentración de proteína de un extracto diluido de manto de mejillón, el posterior cálculo de la concentración en el extracto crudo inicial y determinar el rendimiento de la extracción en forma de mg proteína / g de tejido.

Material: Micropipetas, tubos de pyrex, cubetas para espectrofotómetro, pipetas Pasteur,

Reactivos:

1- Folin A-C: Este reactivo contiene CuSO4, NaOH, y Na2CO3 y Tartrato sódico.

2- Folin Ciocalteau: Contiene: Fosfomolibdeno y Fosfowolframio.

3- Disolución de Seroalbúmina (0.25 mg/mL)

Aparatos: Espectrofotómetro y Vórtex

Reactivo de Lowry: El método de Lowry se aplica para hallar la concentración de proteínas en las muestras. Este método utiliza una solución que contiene cobre (aumenta la sensibilidad en la determinación de proteínas) y un reactivo, llamado Reactivo de Folin, que se reduce en presencia de proteínas. Las especies reducidas cambian su color hacia el azul y son capaces de ser leídas por el espectrofotómetro para averiguar su absorbancia. Si las concentraciones de las proteínas son conocidas, se realiza la curva estándar de calibración. Si, en cambio, las concentraciones de las muestras no son conocidas, se mide su absorbancia, se interpola este valor con la curva de calibración y así se halla la concentración de la muestra incógnita.

Obtención de la muestra: La muestra se obtiene a partir de 9gr. del manto de un mejillón. Mediante un potter se tritura mezclado con un tampón fosfato 1:5 (p/v). Al tenerlo todo homogeneizado se obtienen unos 50mL aprox. A continuación de introduce en una centrífuga a 4ºC durante unos 20´ a 10000 rpm. Al acabar ese tiempo se recoge el sobrenadante, unos 45mL de la S9 final.

Elaboración de la recta patrón

H2O SAB(0.25mg/mL) VT

P1 0.3mL 0.1mL 0.4mL

P2 0.2mL 0.2mL 0.4mL

P3 0.1mL 0.3mL 0.4mL

P4 ---- 0.4mL 0.4mL

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