Detección y aislamiento de un Bacillus Molecular Biology and Biotechnology Core Group, Facultad de Ciencia y Tecnología de Recursos,

Detección y aislamiento de un Bacillus celulolítico y amilolítico a partir de residuos de médula de sagú

Molecular Biology and Biotechnology Core Group, Facultad de Ciencia y Tecnología de Recursos,

Universidad de Malasia Sarawak, 94300 Kota Samarahan, Sarawak, Malasia

El producto de desecho final en la extracción de almidón de la palma de sagú es el residuo de almidón fibroso fibroso. Este residuo es abundante y barato disponible especialmente en el estado de Sarawak, Malasia. Por lo general, se lava en los desagües o arroyos cercanos junto con las aguas residuales, lo que contribuye a la carga de la contaminación o se deposita en el complejo de la fábrica, lo que puede provocar graves problemas ambientales. No tiene un uso industrial o comercial significativo, excepto en una pequeña proporción como alimento para animales, principalmente para cerdos y aves de corral (Yeong y Ali, 1982) o como acondicionador de suelos (Bintoro y Sianapar, 1993). Los estudios han demostrado que el desperdicio de la médula del sagú se compone principalmente del almidón y de la fibra, incluyendo una cantidad justa de minerales. Los contenidos de almidón crudo y fibra cruda oscilan entre 41,7% y 65,0 y 14,8%, respectivamente (Wina et al., 1986). Cuando se considera el componente fibroso y el almidón de los residuos de médula, es lógico encontrar maneras de utilizar este residuo. Los componentes de celulosa y almidón tienen un buen potencial para la bioconversión en productos de valor agregado. Un medio atractivo y eficiente es a través de un enfoque biotecnológico en el que las cepas microbianas se emplean para degradar el desperdicio de sagú. Se sabe que microorganismos tales como hongos y bacterias juegan un papel principal en la degradación de los componentes de celulosa y almidón (Coughlan, 1985). La descomposición de estos componentes producen azúcares simples que encuentran muchos usos en las industrias de alimentación y fermentación.

El primer paso importante en este enfoque es aislar e identificar los microorganismos con las características necesarias como microorganismos celulolíticos y amilolíticos activos. Los hábitats que contienen estos sustratos son las mejores fuentes para encontrar estos microorganismos. En este trabajo se describió el cribado y aislamiento de un Bacillus indígena que es capaz de degradar los sustratos. El aislamiento fue identificado como Bacillus amyloliquefaciens. A nuestro entender, este es el primer informe de una B. amyloliquefaciens que puede utilizar el desecho de palma de sagú. Tres tipos de muestras de residuos de sagú fueron recogidos para este estudio. En primer lugar, el residuo de la médula, el producto de desecho final de la extracción de almidón, se obtuvo de una fábrica de procesamiento de sagú en el distrito de Pusa, Sarawak. Se recogieron muestras alrededor del punto de descarga a una distancia de aproximadamente 3 m de la fábrica. En segundo lugar, se recogieron residuos fibrosos parcialmente descompuestos que comprenden residuos de médula y corteza de alrededor del mismo compuesto de fábrica. Las muestras se recogieron utilizando una pala limpia y se colocaron en bolsas de plástico estériles separadas. En tercer lugar, se recogieron muestras de efluentes residuales de una planta de procesamiento de sagú en Mukah, Sarawak.

Las aguas residuales que contenían una gran cantidad de residuo de médula y algún almidón no separado se recogieron de varios puntos a lo largo de un drenaje abierto. Las muestras de efluente se recogieron en botellas estériles y se mantuvieron a 4ºC hasta su análisis. Se preparó una suspensión al 10% (p / v) de muestras de desecho en agua destilada estéril, y se colocaron alícuotas de 0,1 ml en agar nutritivo (NA) para el aislamiento de bacterias. Se prepararon cuatro repeticiones para cada muestra y las placas se incubaron a 30 - 2ºC. Las colonias bacterianas recuperadas se subcultivaron en NA hasta que se obtuvieron cultivos puros. Los aislados bacterianos se identificaron inicialmente mediante un examen morfológico y una cierta caracterización bioquímica. Los parámetros investigados incluyeron morfología colonial, reacciones de Gram, formación de endosporas, producción de catalasa, crecimiento anaeróbico, reacciones de Voges-Proskauer (V-P), hidrólisis del almidón, utilización de citrato, lecitinasa y crecimiento en presencia de NaCl al 7,5% ya 50ºC. La identificación adicional se llevó a cabo utilizando dos sistemas de identificación comercial, el kit de prueba API 50 CHB (BioMerieux, MarcyI'Etoile, Francia) y el sistema Biolog (Hayward, Estados Unidos). Todos los procedimientos se llevaron a cabo según lo sugerido por los fabricantes. Para la detección de organismos celulolíticos, se cultivaron los aislados en una placa de agar mínimo constituida por extracto de levadura (0,2%), KH _ {2} PO _ {4} (0,1%), MgSO _ {4} (0,5%) y una forma soluble de celulosa carboximetilcelulosa (0,5%). Se incluyeron placas de control negativas inoculadas con cepa de E. coli de laboratorio (HB101) en todas las pruebas. Las placas de ensayo se incubaron a 30 - 2ºC durante 2 días. Para visualizar las zonas de hidrólisis, las placas se inundaron con una solución acuosa de rojo Congo (1 mg / ml) durante 15 min y se lavaron con NaCl 1 M (Teather y Wood, 1982). Los organismos celulolíticos produjeron una zona clara alrededor de las colonias debido a la digestión de la carboximetilcelulosa (CMC). Para la detección de organismos amilolíticos, el organismo se inoculó en placas de agar mínimo (como anteriormente) que contenían almidón soluble (0,5%, p / v) en lugar de CMC. La degradación del almidón resultaría en la formación de una zona clara alrededor de las colonias después de inundar las placas con yodo de Lugol (Hyun y Zeikus, 1985). Los diámetros de la zona clara producidos en CMC y placas de almidón se midieron y se utilizaron como una indicación de las actividades celulolíticas y amilolíticas de los organismos. Además de los limpios en placas, se usó un método de ensayo más cuantitativo para determinar la actividad de celulasa y amilasa del aislado bacteriano seleccionado en medio líquido.

El contenido en azúcares reductores de la hidrólisis del residuo de la médula de sagú se determinó usando el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959). La actividad de la celulasa medida por la actividad carboximetilcelulasa se determinó como se describe por Mandels et al. (1974), usando CMC como sustrato, y se determinó la actividad de amilasa usando almidón como sustrato. La cantidad de azúcares reductores liberados del ensayo se detectó mediante el método DNS. Para detectar el componente de azúcar liberado en el medio de cultivo a partir de la hidrólisis del residuo de la médula de sagú, se utilizó el método de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Los componentes se separaron utilizando un sistema de HPLC Hitachi (Modelo L-6000) equipado con un detector de índice de refracción (RI) (ERC-7515A, ERC Inc., Tokio, Japón), autoamplificador (Modelo AS-2000) Integrador (modelo D-2500). La unidad se equipó con una columna de monitorización de fermentación (150 mm7,8 mm, Bio-Rad, EE.UU.) y una columna de protección (Cation H, Bio-Rad). Antes de la inyección, el eluyente se desgasificó y se filtró a través de una membrana de filtro de 0,45 mm. Se inyectaron exactamente 20 ml de la muestra en la columna con el inyector automático. Las condiciones de análisis se llevaron a cabo a 60ºC ya una velocidad de flujo de 0,6 ml / min. La fase móvil era 1,0 mM H2SO4 y el índice de refracción se fijó a la atenuación 3. Se aisló un total de 84 aislamientos bacterianos del residuo de médula, muestras de efluente y desechos fibrosos parcialmente descompuestos. De estos aislamientos, 52 fueron Gram positivos y 32 Gram negativos. Entre los aislamientos Gram-positivos, el 43% fueron formadores de esporas y formadores de barras, y el resto fueron cocci. El cribado de los aislados con actividad celulolítica y amilolítica reveló que los formadores de esporas eran productores más prolíficos de ambas enzimas en comparación con los aislamientos en forma de cocci. Sin embargo, el cribado para ambas actividades celulolíticas y amilolíticas en placas de agar reveló sólo un aislado (UMAS 1002) que tiene ambas actividades. Es interesante que este aislamiento también se encontró que es el más activo, como lo revela el tamaño de las zonas de limpieza en ambos tipos de placas de agar. Los diámetros de las zonas claras en CMC y placas de almidón fueron 1,7 y 1,45 cm, respectivamente. En las placas NA, el UMAS 1002 produjo colonias cremosas con movimientos circulares. Un examen microscópico del aislamiento mostró que se trata de una espora con una espora en forma de óvalo en el centro. La identificación adicional mediante pruebas bioquímicas estándar mostró reacciones positivas en la prueba de catalasa y en las pruebas de V-P, ONPG, hidrólisis de almidón, gelatina, oxidasa y nitrato.

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