Determinación De Endotoxinas (Primera Parte)

Condiciones generales:

• Todo material que tenga contacto con la ejecución de la prueba debe ser apirógeno.

• La confirmación de la sensibilidad de la etiqueta debe realizarse cada vez que se trabaje con un nuevo lote de LAL.

• Obtener el certificado de análisis de la endotoxina Vs Pyrotell

Preparación de vial CSE (Control Estándar de Endotoxina)

• Retirar protector metálico de vial, cuidadosamente abrir tapa de goma.

• Adicionar 5 ml de agua libre de pirógenos a la endotoxina CSE de concentración 5000 UE/vial. La concentración una vez reconstituida es de 1000 UE/ml.

• Cubrir con parafilm (No volver a usar la tapa de goma)

• Agite fuertemente en el vortex por 1 minuto; dejar reposar por 10 minutos (Repetir este ciclo de mezcla y reposo de 30 a 60 minutos)

• Se puede guardar hasta 4 semanas a una temperatura entre 2 – 8 ºC

Preparación de reactivo Pyrotell (Limulus Amebocyte Lysate)

• Adicionar 5 ml de agua apirógena al reactivo liofilizado LAL (Pyrotell) de sensibilidad 0.125 UE/ml, no agitar para evitar formación de espuma, dejar reposar hasta que la reconstitución este completa.

• Cubrir con parafilm (No volver a usar la tapa de goma)

Preparación de diluciones de endotoxina (CSE)

• Se realizan diluciones de endotoxina a partir del estándar de endotoxina reconstituido (Solución madre) 1000 UE/ml

• 0.1 ml de estándar de endotoxina + 9.9 ml de agua apirógena = 10 UE/ml

• A partir de la solución de 10 EU/ml se realizan las diluciones correspondientes de 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06

• 5 UE/ml (40 λ)= 2 ml de endotoxina (10 UE/ml) + 2 ml de agua apirógena

• 0.5 UE/ml (4 λ) = 0.5 ml de endotoxina (1 UE/ml) + 4.5 ml de agua

• apirógena

• 0.25 UE/ml (2 λ)= 2 ml de endotoxina (0.5 UE/ml) + 2 ml de agua apirógena

• 0.125 UE/ml (1 λ) = 2 ml de endotoxina (0.25 UE/ml) + 2 ml de agua apirógena

• 0.0625 UE/ml (1/2 λ)= 2 ml de endotoxina (0.125 UE/ml) + 2 ml de agua apirógena.

• 0.0312 UE/ml (1/4 λ)= 2 ml de endotoxina (0.125 UE/ml) + 2 ml de agua apirógena.

Nota: λ es la sensibilidad del lisado que será utilizado

Preparación de la mezcla de reacción (Endotoxina – LAL)

• Colocar en una gradilla para tubos de 10 x 75 mm 4 tubos por cada dilución de endotoxina y marcar de izquierda a derecha de la siguiente manera: 0.5; 0.25; 0.125; 0.06; 0.03 y control negativo.

• Adición de endotoxina Con ayuda de una micropipeta cambiando de punta entre cada dilución adicione 100 ul de endotoxina de las concentraciones anteriormente mencionadas a cada tubo;

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