ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA TOXICOLOGIA

ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO[pic 1][pic 2]

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

TOXICOLOGIA

NOMBRE: Dennis Cajamarca

CODIGO: 2298      NIVEL: 9no “A”

FECHA: 2015-10-12

1. EXTRACCIÓN EN FASE SOLIDA:

La EFS se basa en la partición de los compuestos entre una fase líquida (muestra) y una fase sólida (extractante) gobernada por fuerzas intermoleculares entre ambas fases. Los compuestos a ser extraídos deben tener mayor afinidad por la fase sólida que por la matriz de la muestra (fase líquida). La retención puede involucrar fuerzas polares, no-polares y de intercambio iónico. El analito retenido es posteriormente eluído con un pequeño volumen de solvente de elución proporcionando extractos altamente concentrados.

La EFS es la técnica más usual en el pretratamiento muestras antes de su análisis por técnicas instrumentales (HPLC Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento, GC Cromatografía Gaseosa, entre otras). Es útil para realizar extracción del analito, pre concentración del analito y acondicionamiento de la muestra, que puede implicar eliminación de interferencias.

La fase sólida consiste en partículas cromatográficas (sorbente), que pueden estar en diferentes configuraciones: a) Compactadas en discos, b) Empacadas en cartuchos, c) Recubriendo una fibra (micro-extracción en fase sólida), y d) En una barra magnética.

1. Extracción en fase sólida en cartuchos (EFSC):

Las partículas cromatográficas están unidas a sílica o a un polímero y se empacan dentro de cartuchos. La correcta elección del sorbente depende de la naturaleza del analito (polaridad y la presencia de grupos funcionales) que se desea extraer y de las características de los componentes de la muestra. Entendiendo la interacción entre la matriz de la muestra, el analito de interés y el sorbente, se puede mejorar la recuperación.

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La EFS puede utilizarse:

1. Para retener al analito de interés, permitiendo que las interferencias y los componentes de la matriz pasen a través de la columna (elevada constante de afinidad del analito con el sorbente).
2. Para retener las interferencias, permitiendo que los compuestos de interés pasen a través de la columna con la matriz de la muestra (elevada constante de afinidad de las interferencias con el sorbente).

Existen tres tipos de mecanismos para la extracción en fase sólida: fase reversa, fase normal e intercambio iónico. La diferencia entre estos mecanismos radica en las distintas interacciones posibles entre los grupos funcionales de los analitos y los de la fase sólida.

1. Mecanismos de extracción en fase sólida:

1. Fase reversa:

Las retenciones en fase reversa implican matrices polares (usualmente fases líquidas) o moderadamente polar (como fases móviles) y una fase estacionaria no polar. Los sorbentes que más se utilizan son los de Carbono–8 (C–8) y Carbono–18 (C–18), pero también se emplean sorbentes poliméricos. Para romper la fuerza que une al analito con el empacado (proceso de elución) se utiliza un solvente no polar. Aunque si un solvente no polar no es eficiente para eluir al analito retenido, será necesario adicionar un solvente polar (como por ejemplo metanol).

En este tipo de mecanismo, lo deseable es retener al analito de interés, por lo tanto el pH de la muestra debe ajustarse para que la retención sea óptima. Si el compuesto de interés es ácido o básico, debe usarse un pH al que el compuesto no esté cargado. Contrariamente, puede utilizarse un pH al que los compuestos no deseados de la muestra se retengan en el sorbente y el analito de interés pase a través del relleno del cartucho.

1. Fase normal:

Las retenciones en fase normal implican analitos polares en matrices no polares o medianamente polares (acetona, solventes clorados y hexano) y fase estacionaria polar. Se utilizan grupos funcionales polares unidos a la sílica (–CN, –NH2, –Diol). Un compuesto adsorbido por este mecanismo se eluye mediante un solvente más polar que la matriz original (donde estaba contenido el analito).

1. Intercambio iónico:

Las retenciones por intercambio iónico se utilizan para compuestos iónicos contenidos en matrices usualmente acuosas, a veces orgánica. El mecanismo de retención se basa principalmente en la atracción electrostática de los grupos funcionales cargados de los analitos con los grupos funcionales cargados unidos a la sílice.

Para retener un compuesto mediante intercambio iónico, es fundamental que el pH del medio permita que los grupos funcionales del analito y de la superficie de la sílice presenten carga neta, y que la carga sea opuesta entre ellos. Además, el pH no debe permitir que otros compuestos se carguen, para que no interfieran en el proceso de retención.

Como solvente de elución, se utiliza una solución con un pH que neutralice los grupos funcionales del compuesto de interés o los grupos funcionales unidos a la sílice, permitiendo que se rompan las fuerzas electrostáticas que los unen. También puede utilizarse una solución con elevada fuerza iónica o una solución que contenga especies iónicas que reemplacen al analito de interés retenido.

1. Metodología experimental para la extracción en fase sólida:

La extracción en fase sólida es un proceso que implica cinco pasos fundamentales:

Paso 1: Seleccionar una fase sólida apropiada.

• Comercialmente se dispone de tamaños variables de cartuchos, que difieren en la cantidad de relleno, influyendo en su capacidad para retener al analito.
• La capacidad está definida como la cantidad de analito que puede retenerse en el cartucho. La capacidad típica de retención de un sorbente polar o no polar, unido a sílice, es menor al 1 % de la masa del sorbente y ocasionalmente excede el 5 %, dependiendo de la naturaleza del sorbente, analito y matriz.
• En un sorbente de intercambio iónico, la capacidad esta definida como el número de sitios iónicos que pueden interaccionar con especies iónicas de la muestra.

Paso 2: Acondicionar el sorbente.

• Mediante solvatación se prepara al sorbente para que la interacción con los analitos sea reproducible. La solvatación es el proceso de atracción y asociación de moléculas de un solvente con moléculas o iones de un soluto.
• Para extracción en fase reversa, usualmente, se acondiciona pasando un volumen apropiado de agua, seguido por un volumen de un solvente orgánico miscible en agua (por ejemplo, metanol) y por último agua o una solución reguladora acuosa.
• Para extracciones en fase normal se utiliza el mismo solvente orgánico en el que está disuelta la muestra. En extracciones por intercambio iónico con matrices no polares se utiliza el mismo solvente orgánico de la muestra. Para matrices polares se utiliza agua, luego un solvente orgánico miscible en agua, y por último una solución acuosa con pH y fuerza iónica adecuados.

Paso 3: Transferir la muestra al cartucho de extracción.

• La cantidad de muestra disponible puede estar comprendida en un rango muy extenso, desde pocos microlitros a varios litros, pero es una condición esencial que esté en una forma compatible con el sistema de EFS.
• Para favorecer la retención del analito en el sorbente y para evitar el taponamiento del relleno, es necesario que la muestra esté limpia, es decir, sin partículas ni materiales en suspensión y libre de todo tipo de material interferente. Por este motivo, para determinadas matrices es necesario realizar un paso previo de acondicionamiento, que puede consistir en un proceso de precipitación, centrifugación y/o filtración o en ajustar el contenido de solvente orgánico, pH y/o fuerza iónica.
• La muestra debe pasarse, a través del cartucho, con una velocidad de flujo apropiada, ya que puede afectar la retención de ciertos compuestos.

Paso 4: Lavar el empacado.

• Si el mecanismo de EFS implica la retención del compuesto de interés, el lavado deberá eliminar los compuestos no deseados o retenidos débilmente. Para ello, se debe utilizar el mismo solvente en el que está disuelta la muestra o alguna otra solución que no elimine el analito de interés. En general, se necesita no más del volumen total del cartucho.

Paso 5: Eluir el compuesto de interés.

• La mínima cantidad de solvente de elución, necesaria para eluir al analito, esta definida como 2 veces el volumen de elución del sorbente que corresponde a 120 µL por 100 mg de sorbente.
• Para la elución del analito se utiliza una solución que rompa las interacciones entre el analito y el sorbente, pero que deje retenidas las impurezas que no pudieron eliminarse en el paso de lavado. El eluído se recolecta para su posterior análisis.
• Para que la elución sea más eficiente es conveniente utilizar dos alícuotas del volumen total de elución, en vez de una sola. Además, la eficiencia aumenta cuando el tiempo de contacto del solvente con el sorbente es de 20 a 60 seg.
• Tiempos de contacto muy breves o muy elevados no son beneficiosos.
• Por último, puede evaporarse el eluído y resuspenderse en otro solvente compatible con la técnica de análisis.

1. Ventajas y Desventajas:

El amplio rango de fases sólidas disponibles en el mercado posibilita una correcta elección de acuerdo con la selectividad que se desee, permitiendo la extracción de todos los compuestos de matrices acuosas u orgánicas. También se dispone de varios sistemas manuales y automáticos, en discos, cartuchos y microfibras, con la posibilidad de automatización y acople al sistema de separación.

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