EXTRACCIÓ AQÜOSA EN DUES FASES: PURIFICACIÓ DE L’HEMOGLOBINA MITJANÇANT UN SITEMA PEG-DEXTRÀ

EXTRACCIÓ AQÜOSA EN DUES FASES: PURIFICACIÓ DE L’HEMOGLOBINA MITJANÇANT UN SITEMA PEG-DEXTRÀ

INTRODUCCIÓ

1.1. Extracció aqüosa en dues fases

L’extracció aqüosa en dues fases és una tècnica usada a la indústria biotecnològica per tal d’aïllar i purificar una gran varietat de proteïnes i materials biològics diversos incloent partícules subcel•lulars i cèl•lules senceres. Aquesta tècnica va ser desenvolupada per Albertsson (2).

Els sistemes de dues fases es realitzen tot combinant dos polímers imcompatibles solubles en aigua (PEG i dextrà) o bé un bé un polímer i sal amb aigua, per sobre d’una concentració crítica. Aquests sistemes es separen en dues fases líquides immiscibles, l’una enriquida en un polímer i l’altra enriquida en un altre polímer o sal. Els materials solubles, com per exemple proteïnes, que s’afegeixen al sistema, es reparteixen entre les dues fases (3). Aquest és el principi de l’extracció.

En aquesta pràctica el sistema bàsic que s’ha escollit és PEG/ dextrà perquè les seves propietats físiques el fan adeqüat per a una extracció proteica sense exercir efectes nocius sobre la proteïna. Els coeficients de partició de les substàncies a separar poden ser manipulats en un sistema de dos polímers per l’addició d’àcid, base, intercanvi iònic o no iònic i surfactants.

1.2. Mesures físiques

En una extracció simple, una solució de dextrà (fase pesada) amb una certa quantitat de proteïna es barreja amb una solució de PEG (fase lleugera). El repartiment de proteïna entre les dues fases fins arribar a l’equilibri s’assoleix i es defineix com a K.

K=y/x , on:

y= concentració de proteïna a la fase orgànica.

x= concentració de proteïna a la fase aqüosa.

Els objectius de la pràctica són:

1.Observar la formació de les dues fases PEG / dextrà per sobre de certes concentracions.

2. Estimar els ratios de volum entre fases.

3. Determinar el coeficient de repartició a l’equilibri de la proteïna.

4. Determinar el rendiment del producte.

2. PROCEDIMENT

1) Solucions aqüoses a emprar:

a. PEG al 50% (w/w), Mw=8000

b. Hemoglobina 10 mg/ml, Mw=64,500 en 0,1 M de buffer fosfat sòdic pH=7.8.

c. 0,1 M de buffer fosfat pH=7.8

d. Dextrà al 25% (w/w), Mw=480,000.

2) Determinació de la massa de cada solució i de NaCl sec necessaris per combinar i formar els 4 sistemes fàsics amb les composicions especificades en el quadre següent (fig.1). Hi haurà un total de 6 sistemes fàsics, un per cadascun excepte en el cas del sistema 3 que en tindrà tres.

Fig.1. Composició dels sistemes fàsics

3) Formulació dels sistemes fàsics.

a. Col•locar un tub graduat cònic

...