El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio),

 El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye muchas técnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos, material vegetal o animal en condiciones controladas y asépticas. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas, o transgénicas, mediante técnicas de ingeniería genética.  Es decir que existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos vegetales y la biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos, seguido de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente expresión de los genes introducidos, o transgenes (Ver Cuaderno N° 5, 18, 28, 98).Cultivo in Vitro de material vegetal“Cultivo de tejidos vegetales” es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas (ver Cuaderno Nº 56). Las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias). Esta técnica tiene numerosas aplicaciones (ver Cuadernos 5, 26, 56, 89, 93): •Propagación masiva de plantas, especialmente beneficiosa para especies de difícil •propagación por otros métodos, o en vías de extinción•Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año •Obtención de plantas libres de virus•Producción de semillas sintéticas •Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la variabilidad genética de una población vegeta•Obtención de metabolitos secundarios•Producción de nuevos híbridos•Mejora genética de plantas, incluyendo obtención de plantas transgénicas•Germinación de semillas. •Producción de haploides. •Estudios fisiológicos diversos. Algunas de estas aplicaciones se ilustran en la Figura 1. Figura 1. Aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. A la izquierda, micropropagación de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. A la derecha, semillas sintéticas formadas por embriones somáticos, obtenidos por cultivo de células, encapsulados en una matriz inerte (como alginato de calcio). Fotografía tomada de: http://www.sp.edu.sg/schools/cls/bioline_08.htmLas bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celularAntes de comenzar con la descripción del cultivo de tejidos vegetales y sus aplicaciones, se muestra la anatomía de una planta en la figura 2.Figura 2: las partes de una planta angiosperma. Adaptado del Libro “Biotecnología”, UNQ 2006.Respecto del proceso de transformación vegetal, existen distintas técnicas para la transferencia de genes a las células vegetales, siendo las principales la interacción con bacterias del género Agrobacterium y el método de Biobalística (Cuadernos 18 y 28, respectivamente). Una vez realizada la transformación genética por alguno de estos dos métodos, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de regenerar plántulas a partir del explanto inicial transformado, proceso que se sustenta en el principio de “totipotencialidad celular” (ver Cuaderno Nº 56, 98). De aquí la importancia del cultivo in vitro como paso fundamental para la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas (ver figura 3).Figura 3. Cultivo de tejidos y transformación vegetal. En la figura se observan explantos que, luego del proceso de selección, han perdido coloración y, aquellas células transformadas exitosamente, se han desdiferenciado y rediferenciado para dar origen a un brote (ver texto). La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular (ver Cuaderno Nº 56, 70, 83), y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. Básicamente, la reproducción asexual se puede realizar debido a que las células vegetales poseen un mecanismo de división mitótico, al igual que las células animales, mediante el cual cumplen sucesivas etapas de crecimiento y desarrollo. La división celular mitótica implica una replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo que las  mismas poseen un genotipo idéntico al de la célula madre. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta (ver Cuaderno Nº 70, 80, 83).Así, las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:i)  una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametas), ii) una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos). La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa.  Como se comentó previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas. La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.El éxito en la propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. Para lograrlo, debe inducirse  primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de Begonias, Violeta africana (ver figura 1) o Peperonias mediante porciones de hojas. Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada, es la composición del medio de cultivo. En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una plantaPasos para generar plantas a partir de explantos aisladosEn los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro, se pueden distinguir las siguientes etapas (sintetizadas en la figura 4): 1)Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.2)Establecimiento: desinfección de los explantos (generalmente con  hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee.3)Multiplicación: generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.4)Enraizamiento: formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.5)Rusticación: aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones medioambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)Ampliar Imagen Figura 4. Etapas de la regeneración in Vitro de maíz. Fuentes:1. http://www.cid.csic.es/departaments/genetica/torne/indexC.html2. http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e28_2/maize.html El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones mediambientales. Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material in vivo (ver Cuaderno Nº 98). Algunos elementos necesarios para hacer cultivo de tejidos vegetalesPara llevar adelante este trabajo, se necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra con la que se desea trabajar (figura 5).Figura 5. Flujos laminares para el cultivo de tejidos. Se observa uno de los modelos de flujo laminar que puede usarse para preservar la esterilidad de las muestras. Imagen: www.jaelsa.com/laboratorio4.htmlAdemás, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido, y que está conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento  y hormonas vegetales (ver Tabla 1) que ayudarán a obtener una planta completa, o un órgano vegetal en particular, a partir del explanto elegido (en condiciones de esterilidad). Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.), que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre pH=5 y 6,5.Luego, se regulan las condiciones de temperatura, y de fotoperíodo (relación de horas luz y horas oscuridad).Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo, se puede propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales. Por ej., si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor a 1, se favorece la generación de brotes; si es menor a 1, la generación de raíces; si es igual a 1, la formación de callos. Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetalesRelación del cultivo in Vitro con la Biotecnología La micropropagaciónLa propagación de plantas in vitro es una técnica de la biotecnología muy utilizada en cultivos de importancia económica. Como fue mencionado anteriormente permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son realizados por personal especializado, con agentes  específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y en condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz) (figura 6). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a escala industrial.La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.Ventajas de la micropropagación- Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.- Permite controlar las condiciones ambientales, - Permite estudiar diversos procesos fisiológicos- Evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se realiza en medios esterilizados).- Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.- Permite la obtención de individuos uniformes.- Facilita el transporte del material.Figura 6. La micropropagación vegetal. A partir de una planta madre, se obtienen numerosos explantos que, sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales o similares a la planta original, permitiendo su multiplicación. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ 2006Cultivo de meristemasEn la yema apical se encuentra un grupo de células que conforman el meristema apical (con un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas (figura 7).Figura 7. Cultivo de meristemas. a partir de un meristema aislado, se puede obtener una planta completa. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ 2006El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes, es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no está afectada por estos patógenos vegetales. Otra aplicación es la multiplicación vegetal de enorme potencial: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4 millones de claveles en un año.La técnica permite multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas), o acelerar la producción de plantas bianuales. Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactoresUna vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensión de células. La misma puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas sintéticas), o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia, entre otras (ver Cuadernos 17, 21, 25, 29, 45, 49, 51, 52). Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, algunos edulcorantes, entre otros. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad (de unos pocos a miles de litros), diseñados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicación de distinto tipo de células y/u órganos (figura 8). Figura 8. Cultivo de células y órganos vegetales. A partir de un explanto, se pueden establecer cultivos de células para producir compuestos de interés, o para obtener embriones somáticos y semillas artificiales, entre múltiples aplicaciones. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ 2006.Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas porAgrobacterium rhizogenes, que produce un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la raiz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad de producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por cultivo de raíces es el paclitaxel, o taxol, que es utilizado como anticancerígeno. 

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