Propagacion Por Cultivo In Vitro

PROPAGACION POR CULTIVO IN VITRO

La expresión cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio) de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales:

• la asepsia (ausencia de gérmenes, etc), y

• el control de los factores que afectan el crecimiento.

El avance alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio general se aplica también al cultivo in vitro de plantas.

Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el ambiente de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón se realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo sino con solamente una parte del mismo, se utiliza el término explante para indicar la parte del órgano ó tejido vegetal que se cultiva in vitro. A la dificultad de reproducir las condiciones naturales en condiciones de laboratorio, se debe añadir en este caso la dificultad de suministrar al explante todo aquello que antes obtenía del sistema completo.

En resumen, el cultivo in vitro de plantas es una técnica que exige un control específico del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante. Conviene, por tanto, conocer cuáles son los principales factores que conforman dicho y que deberán ser controlados.

Características de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo):

In vitro

• No realiza fotosíntesis

• Crecimiento en condiciones controladas

• Crecimiento en condiciones de asepsia

• Alta humedad relativa

• Estomas no funcionales

• Ausencia de pelos radiculares

• Ausencia de cera en la cutícula

In vivo

• Realiza fotosíntesis

• Crecimiento en condiciones no controladas

• Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente

• Humedad relativa variable

• Estomas funcionales

• Presencia de pelos radiculares

• Presencia de cera en la cutícula

CARACTERISTICAS

1. El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales.

2. El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo.

3. Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave.

4. El cultivo in vitro es muy caro, entre otras cosas porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos laboratorios muy grandes y con mucho mercado.

La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.

Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro:

• Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:

- Micropropagación de estaquillas

- Organogénesis de callos

• Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:

- Cultivo de meristemos

- Microinjerto in vitro

• Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.

• Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.

• Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

• Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.

• Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.

• Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:

- Obtención rápida de homocigotos.

- Producción de híbridos (frutos puros).

Equipo necesario para el cultivo in vitro

• Autoclave: Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteínas. Es como una olla a presión, pero de mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º).

• Cámara de flujo laminar: Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

• Medio de cultivo: Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.

• Planta: El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que haya menos infecciones.

• Cámara de cultivo: La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc.

Condiciones del cultivo in vitro

• En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.

• En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas

• El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.

• Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.

• El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5.

• Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.

• El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

• El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo.

• En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.

• Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta.

• En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.

En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro se pueden distinguir las siguientes etapas:

1) Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.

2) Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee.

3) Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

4) Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.

5) Rusticación, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte).

Composición de medios de cultivo para células vegetales

Componentes Características y ejemplos

Agua destilada Representa el 95% del medio nutriente

Fuente de carbono Generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita

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